Observación de Mycoplasma sp. Por M.E., tratamiento, eliminación y confirmación por PCR anidada

FADER, CM; MEDERO, A., ; FURLÁN, M.; COLOMBO, M.I

Rosario

Congreso; 10th Inter-American Congress on Electron Microscopy (CIASEM 2009); 2009

CIASEM

El cultivo celular juega un rol creciente en la biotecnología moderna y es fundamental en el desarrollo de los proyectos de investigación de numerosos laboratorios. La contaminación de los cultivos por hongos y bacterias es frecuente y tratable, pero una contaminación grave y no fácilmente detectable son los Micoplasmas, los cuales causan modificaciones severas que alteran el funcionamiento normal de las células. Los micoplasmas son un género de bacterias que carecen de pared celular (1), en los cuales se incluye bacterias que tienen genomas pequeños y tienen un bajo contenido de GC (18-40%). Hasta el momento se han identificado más de 100 especies reconocidas del género Mycoplasma, las cuales debido a la ausencia de pared no se ven afectados por algunas antibióticos como la penicilina u otros antibióticos betalactámicos que bloquean la síntesis de la pared celular. Este microorganismo parasita de algunos vertebrados, siendo una de varias especies patógenos de los seres humanos y agente causal de la neumonía atípica y otros trastornos respiratorios. Así mismo, se cree que está involucrado en las enfermedades inflamatorias pélvicas. Por otro lado, Micoplasmas es un contaminante frecuente en los cultivos celulares de los laboratorios de investigación, siendo las causas más comunes de contaminación las que se producen a través del operario de la sala de cultivo o a la utilización de cultivos contaminados, en especial cultivos primarios de células. Este microorganismo por lo general induce cambios celulares, como cambios en el metabolismo y el crecimiento celular, e infecciones graves pueden destruir una línea celular. El Mycoplasma mide menos de 1 ìm, es un patógeno que difícilmente pueda ser detectado por microscopía convencional. Entre las prácticas más utilizadas para su detección están: tinción de ácidos nucleicos por medio del reactivo de Hoesch con observación por microscopía de fluorescencia (siendo poco específica sobre todo cuando los niveles de infección son bajos) y cultivos microbiológicos (técnica lenta). En nuestro laboratorio hemos observado por técnicas de microscopia electrónica de transmisión y de crio-ultramicroscopía electrónica la presencia de Mycoplasma sp. en diferentes líneas celulares, logrando mayor especificidad en menor tiempo. Por otro lado hemos podido detectar por crio-ultramicroscopía electrónica el alto grado de reactividad que posee Micoplasma para un gran número de anticurepos utilizados para el estudio del tráfico intracelular, siendo este un inconveniente, debido a que puede ingresar por endocitosis en un gran numero de tipos celulares, pudiendo dar falsos positivo en la detección de determinadas proteínas intracelulares, sobre todo por microscopía de fluorescencia. Para confirmar la observación del microorganismo por microscopía electrónica se puso a punto la detección de Mycoplasma mediante PCR anidada. Esto fue posible debido a los avances recientes en la biología molecular y genómica, los cuales posibilitaron la caracterización completa del genoma de muchos de los tipos de Micoplasma permitiendo el diseño de primers que amplifiquen una secuencia común de los Micoplasmas contaminantes de los cultivos celulares. Una vez corroborada su presencia, la línea celular contaminada es tratada con antibióticos y controlada nuevamente por microscopia electrónica y PCR, ratificándose la eliminación de la contaminación, logrando de esta manera que las líneas celulares usadas en investigación estén en condiciones óptimas de trabajo, evitando la perdida de tiempo por cultivos de crecimiento lento y garantizando un mejor análisis de los resultados obtenidos.