Transferencia de genes mediada por espermatozoides (SMGT) en inseminación artificial en bovinos (Bos taurus)

DÍAZ-PUMARÁ, PATRICIO; VAZQUEZ-LEVIN, MÓNICA HEBE; VERÓN, GUSTAVO LUIS; VISCA, H; UDAQUIOLA, M

Jornada; XXIV Jornada Anual SAB 2022; 2022

La modificación del genoma en vertebrados mamíferos superiores se encuentra en desarrollo precario, en gran parte, debido al alto costo, baja eficiencia y alto riesgo biológico de los métodos utilizados. Buscamos estandarizar métodos que, utilizando el espermatozoide, como vector de construcciones génicas heterólogas, produzcan transgénesis en el acto de la fecundación en diferentes especies ya sea por la Fecundación In-Vitro (FIV), como por Inseminación Artificial (IA). En este trabajo nos propusimos lograr embriones genéticamente modificados en la especie bovina por IA. Dos toros donantes de semen del Centro Genético Las Lilas fueron evaluados en cuanto a su capacidad de internalizar ADN en el espermatozoide (SPZ) debidamente tratado, utilizando dos concentraciones del plásmido comercial (pEGFP N-1 4,7kb), marcado con Cy3. Se analizaron alícuotas de suspensiones espermáticas tratadas y no tratadas bajo microscopio de captura laser (Nikon TE 2000). Uno de los toros evidenció mejores índices de captación. El toro y la concentración elegidos, fueron utilizados para tratar alícuotas de SPZs en cantidad suficiente para inseminar un total de 4 hembras bovinas adultas, estimuladas hormonalmente (TSOV) para lograr la superovulación. El TSOV se realizó mediante inserción de pesario vaginal de progesterona (DIB de 1 g) el día “0”, por siete días, asociado, desde el día “4” del tratamiento, a una secuencia de 4 dobles dosis/día de hormona Folículo Estimulante porcina (FSHp), más doble dosis de PGF2a el día 6 y una dosis de GnRH el día 8, día del celo. Los días “8” y “9” desde el inicio del tratamiento, ocho dosis de semen de 5 x 106SPZs, dos sin tratar y seis tratadas, fueron utilizadas para inseminación intrauterina profunda, en doble dosis, mitad cuerno derecho, mitad cuerno izquierdo, con doce horas de intervalo en cada animal experimental. El día 15 desde el inicio del TSOV (D “0”) se realizó colecta embrionaria no-quirúrgica transcervical. Las tres vacas inseminadas con semen tratado y la vaca inseminada con semen no tratado (control) dieron 24 estructuras embrionarias (ES). Se obtuvieron 18 embriones (E) y 6 huevos no fertilizados (UO). 15 E de 3 vacas del grupo tratado mostraron fluorescencia verde (GF) y roja (RF), 3 E del grupo control fueron negativos a GF y RF, así como, 3 UO obtenidos de ambas categorías. Los resultados mostraron eficiencia de transfección positiva de los espermatozoides a los óvulos, ya que todos los embriones logrados del grupo tratado, en las tres vacas, muestran fluorescencia verde y roja en alguno, o todos, los blastómeros, mientras que los embriones obtenidos de la vaca control, y los ovocitos no fertilizados no mostraron fluorescencia.