OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS DE ORIGEN EPITELIAL PARA EL AISLAMIENTO DE LOS VIRUS CAEV Y ORFV

OSVALDO ZABAL; ANA MARIELA DORDERO; RAMSES REINA; VALENZANO MAGALI; PERALTA ANDREA

Jujuy

Congreso; ASOCIACIÓN ARGENTINA DE VETERINARIOS DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO; 2016

INTRODUCCIÓNEn el diagnóstico confirmatorio de enfermedades virales se suelen emplear técnicas serológicas (ELISA e inmunodifusión en agar AGID) o moleculares (PCR, RT-PCR) para la detección de los agentes virales. Si bien, muchas veces los reactivos necesarios suelen ser caros y poco accesibles al evaluar un gran número de muestras. Además, en muestras biológicas donde la carga viral suele ser baja, las técnicas antes mencionadas suelen presentar limitaciones. La forma de confirmar la presencia del agente viral es obtener su aislamiento en cultivo de células, siguiendo la aparición del efecto citopático característico para cada uno de ellos. Sin embargo, es habitual que la cepas de campo no se adapten a su multiplicación in vitro en líneas celulares establecidas, por lo que muchas veces es necesario recurrir a los cultivos primarios.El objetivo de este trabajo consistió en la generación de un cultivo primario de origen epitelial ovino y caprino con el fin de obtener un sistema celular que permita el aislamiento de los virus de artritis y encefalitis caprina (CAEV) y el virus ORF (ORFV),agente causal del Ectima contagioso, a partir de muestras sospechosas.MATERIALES Y MÉTODOSSe utilizaron ovinos y caprinos adultos, se los inmovilizó, se realizó la tricotomía de la zona inguinal y los lavados quirúrgicos para luego inyectarle subcutáneamente lidocaína 1% con epinefrina en forma de ele (L) y una vez insensibilizada la zona, se realizó una biopsia, en un primer ensayo de 1cm cuadrado de piel, mientras que en los ensayos subsiguientes se extrajeron explantes longitudinales de 1cm x 5cm. El tejido fue colocado inmediatamente en PBS adicionado con una solución de antibióticos-antimicótico (ATB/ATM) para su traslado refrigerado hasta el laboratorio en menos de 24h. La herida del animal se suturó con puntos simples, desinfectando y previniendo la producción de miasis con el uso de piretroides en aerosol.El tejido fue lavado dos veces con PBS-ATB/ATM y a continuación se procedió a una disgregación mecánica y enzimática, mediante agitación en una solución de tripsina 0,25% durante 20min a 37°C. Finalizado ese tiempo, se recuperó la solución de tripsina y se centrifugó (800 g, 5 min a temperatura ambiente) obteniéndose el pellet de células. Se repite el procedimiento 5 veces hasta procesar completamente el tejido disgregado. Todos los pellets celulares recuperados fueron sembrados en botellas de cultivo T75 con medio MEM-D y 10% de suero fetal bovino, con el agregado de una solución de ATB/ATM.Los cultivos primarios obtenidos Eov (epitelio ovino) y Eca (epitelio caprino) fueron evaluados tomando diferentes criterios: recuperación celular, números de pasajes, viabilidad luego de un ciclo de criopreservación y susceptibilidad a los virus CAEV y ORFV.Los inóculos virales utilizados para CAEV consistieron en líquido articular de animales con síntomas clínicos y ELISA positivo, mientras que las muestras para ORFV consistieron en el macerado con nitrógeno líquido de costras de ovinos con diagnóstico clínico de Ectima y PCR positiva. Se prepararon monocapas de Eov y Eca en placas de 12 wells y se desafiaron con los inóculos de CAEV y de ORFV y se las observó hasta la aparición del efecto citopático característico para cada virus.RESULTADOSLas células epiteliales obtenidas por disgregación del tejido demoraron entre 10 y 20 días en desarrollar una monocapa adherida, se observó que el porcentaje de células tipo fibroblastos fueron las que desarrollaron y completaron la monocapa celular. A partir de estos cultivos se realizaron subcultivos y se criopreservaron en los pasajes n°2, 4 y 6. Luego de un mes crioconservadas (en N2 líquido), fueron descongeladas y se observó una viabilidad del 90% y un crecimiento normal.A partir del pasaje n°8 para el cultivo Eov y del n°6 para Eca se observa la selección de clones celulares, tipo fibroblásticos, con los cuales se intentará obtener una línea establecida y sensible a los virus de ovinos y caprinos.En los ensayos para evaluar estos cultivos en cuanto a la susceptibilidad a la infección con los virus CAEV y ORFV se utilizaron los pasajes n°4 para Eca y n°6 para Eov. Para el caso de las células infectadas con líquido articular se observó la formación de sincicios, efecto citopático característico del virus CAEV en cultivo; mientras que en el caso de las células infectadas con ORFV se observó que las células se redondean, pierden adherencia al plástico y forman grumos, efecto citopático descripto en la bibliografía para el virus ORF. DISCUSIÓN Fue posible obtener cultivos primarios epiteliales de origen ovino y caprino, estables al menos hasta el pasaje n°8, con alta recuperación luego de su criopreservación y que permite observar el efecto citopático esperado para los virus CAEV y ORFV.Estos cultivos resultan una valiosa herramienta para lograr el aislamiento de cepas de campo tanto de CAEV como de ORFV, que permitirán luego su confirmación molecular, caracterización y determinación de la variabilidad entre las cepas que circulan en nuestro país.