Desarrollo de una estrategia de metabolómica no dirigida para evaluar el impacto de NEDD8 sobre el perfil metabólico neuronal

MANUELA R. MARTINEFSK; MALENA MANZI; LINENBERG, IVANA; GIUSTI, SEBASTIAN; DAMIAN REFOJO; MARÍA EUGENIA MONGE

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masas; 2022

El grupo de investigación de Neurobiología Molecular del IBioBA-Max Planck ha identificado a NEDD8 como una modificación post-traduccional que impacta sobre centenas de proteínas intracelulares y además es esencial en neuronas para el desarrollo, mantenimiento y función de dendritas y sinapsis.1-3 Resultados previos del grupo de investigación sugieren que la neddilación podría cumplir un rol muy relevante en el metabolismo celular.2 En el presente trabajo, se desarrolló un método analítico mediante un abordaje de metabolómica no dirigida utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de alta resolución mediante una fuente de ionización por electrospray (UPLC-ESI-HRMS), para estudiar el impacto de la actividad neuronal y la inhibición de la neddilación sobre el perfil metabólico neuronal. Para ello, se desarrolló un método de extracción de metabolitos intracelulares a partir de muestras de cultivos primarios de neuronas corticales e hipocampales de modelos murinos. La metodología propuesta para la preparación de muestras involucró una etapa de quenching del metabolismo celular utilizando nitrógeno líquido y posterior extracción del endometaboloma con una mezcla de agua:metanol:acetonitrilo (10:50:40 v/v/v). Asimismo, se seleccionaron los compuestos marcados isotópicamente para ser utilizados como estándares internos que permitan identificar fuentes de variabilidad asociadas a la preparación de las muestras y a la variabilidad instrumental en el abordaje no dirigido y así poder identificar potenciales outliers y evaluar la calidad de los datos. Para separar y detectar los metabolitos, se desarrolló un método de cromatografía hidrofílica (HILIC). Las fases móviles consistieron en una solución 5 mM de acetato de amonio pH 3,5 con 5% de acetonitrilo (A) y acetonitrilo (B), utilizando un gradiente de 16 minutos. La temperatura de la columna fue de 35 ºC y las muestras se mantuvieron a 5 ºC durante el análisis. Se utilizó un espectrómetro de masas con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo, el cual fue operado en ambos modos de ionización y los datos fueron procesados por Progenesis QI y TidyMS (https://github.com/griquelme/tidyms). El método se optimizó para evitar carry-over, y fue exitosamente evaluado en un estudio piloto que involucró el análisis de muestras de neuronas en cultivo que fueron sometidas a los siguientes tratamientos: i) DMSO (control), ii) MLN4924 (inhibidor de neddilación), iii) tratamiento con 4AP/Bic (activación neuronal) en DMSO; iv) MLN4924 + 4AP/Bic Los resultados preliminares sugieren que existen variables metabólicas discriminantes que permiten diferenciar los tratamientos evaluados.