Desarrollo de una estrategia de metabolómica no dirigida para evaluar el impacto de NEDD8 sobre el perfil metabólico neuronal.

MARTINEFSKI, MANUELA; MALENA MANZI; IVANA LINENBERG; SEBASTIAN GIUSTI; DAMIÁN REFOJO; MARIA EUGENIA MONGE

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masas; 2022

El grupo de investigación de Neurobiología Molecular del IBioBA-Max Planck ha identificado aNEDD8 como una modificación post-traduccional que impacta sobre centenas de proteínasintracelulares y además es esencial en neuronas para el desarrollo, mantenimiento y función dedendritas y sinapsis.1-3 Resultados previos del grupo de investigación sugieren que la neddilaciónpodría cumplir un rol muy relevante en el metabolismo celular.2 En el presente trabajo, sedesarrolló un método analítico mediante un abordaje de metabolómica no dirigida utilizandocromatografía líquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de altaresolución mediante una fuente de ionización por electrospray (UPLC-ESI-HRMS), para estudiar elimpacto de la actividad neuronal y la inhibición de la neddilación sobre el perfil metabóliconeuronal. Para ello, se desarrolló un método de extracción de metabolitos intracelulares a partir demuestras de cultivos primarios de neuronas corticales e hipocampales de modelos murinos. Lametodología propuesta para la preparación de muestras involucró una etapa de quenching delmetabolismo celular utilizando nitrógeno líquido y posterior extracción del endometaboloma conuna mezcla de agua:metanol:acetonitrilo (10:50:40 v/v/v). Asimismo, se seleccionaron loscompuestos marcados isotópicamente para ser utilizados como estándares internos que permitanidentificar fuentes de variabilidad asociadas a la preparación de las muestras y a la variabilidadinstrumental en el abordaje no dirigido y así poder identificar potenciales outliers y evaluar lacalidad de los datos. Para separar y detectar los metabolitos, se desarrolló un método decromatografía hidrofílica (HILIC). Las fases móviles consistieron en una solución 5 mM de acetatode amonio pH 3,5 con 5% de acetonitrilo (A) y acetonitrilo (B), utilizando un gradiente de 16minutos. La temperatura de la columna fue de 35 oC y las muestras se mantuvieron a 5 oC duranteel análisis. Se utilizó un espectrómetro de masas con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo, elcual fue operado en ambos modos de ionización y los datos fueron procesados por Progenesis QIy TidyMS.4 El método se optimizó para evitar carry-over, y fue exitosamente evaluado en unestudio piloto que involucró el análisis de muestras de neuronas en cultivo que fueron sometidas alos siguientes tratamientos: i) DMSO (control), ii) MLN4924 (inhibidor de neddilación), iii)tratamiento con 4AP/Bic (activación neuronal) en DMSO; iv) MLN4924 + 4AP/Bic.1 Vogl, A. M.; Brockmann, M. M.; Giusti, S. A.; Maccarrone, G.; Vercelli, C. A.; Bauder, C. A.; Richter, J. S.; Roselli, F.;Hafner, A. S.; Dedic, N.; Wotjak, C. T.; Vogt-Weisenhorn, D. M.; Choquet, D.; Turck, C. W.; Stein, V.; Deussing, J. M.;Refojo, D., Neddylation inhibition impairs spine development, destabilizes synapses and deteriorates cognition. NatureNeuroscience 2015, 18 (2), 239-51.2 Vogl, A. M.; Phu, L.; Becerra, R.; Giusti, S. A.; Verschueren, E.; Hinkle, T. B.; Bordenave, M. D.; Adrian, M.;Heidersbach, A.; Yankilevich, P.; Stefani, F. D.; Wurst, W.; Hoogenraad, C. C.; Kirkpatrick, D. S.; Refojo, D.; Sheng,M., Global site-specific neddylation profiling reveals that NEDDylated cofilin regulates actin dynamics. Nature Structural& Molecular Biology 2020, 27 (2), 210-220.3 Brockmann, M. M.; Döngi, M.; Einsfelder, U.; Körber, N.; Refojo, D.; Stein, V., Neddylation regulates excitatory synaptictransmission and plasticity. Scientific Reports 2019, 9 (1), 17935.4 Riquelme, G.; Zabalegui, N.; Marchi, P.; Jones, C. M.; Monge, M. E., A Python-Based Pipeline for Preprocessing LC–MS Data for Untargeted Metabolomics Workflows. Metabolites 2020, 10 (10), 416.