Construcción de un nuevo micobacteriófago reportero luminiscente nanoluc y su uso para la evaluación extracelular in vitro de drogas antituberculosas

RONCONI LISANDRO; SPATOLA ROSSI CARLA; URDANIZ ESTEFANIA; DURAN FERNANDO; PIURI MARIANA

Jornada; Segundas Jornadas Latinoamericanas de Bacteriofagos; 2022

Frente al alarmante incremento de los casos de tuberculosis y otras micobacterias reportados cada año por la Organización Mundial de la Salud (OMS), en paralelo con el aumento de aislamientos resistentes a drogas de primera y segunda línea, es inminente la necesidad de nuevos agentes terapéuticos con blancos de acción diferentes a los conocidos. Junto a esto, es de vital importancia implementar ensayos de evaluación de drogas de forma eficaz y rápida para acortar los tiempos y decidir las rutas sintéticas de los análogos evaluados. El uso de micobacteriófagos reporteros como método de detección de la actividad antimicobacteriana resulta práctico, sensible, rápido y de bajo costo.Con este fin, se propuso construir un nuevo micobacteriófago reportero que acarrea un gen que codifica para la enzima luminiscente NanoLuc de pequeño tamaño, estable, monomérica y ATP-independiente. Estas ventajas la hacen eficaz para su empleo como reportero para la evaluación extracelular in vitro de compuestos antituberculosos (anti-TB) y ensayos de High Throughput Screening (HTS).La construcción del micobacteriófago se realizó mediante la incorporación del gen de la luciferasa Nluc (Promega) en el fásmido phAE159 que fue empleado previamente como base en la construcción de fagos reporteros fluorescentes. Se llevó a cabo una estrategia de clonado mediante la cual se reemplazó el plásmido pYUB328 presente en el phAE159 con el plásmido pYUB54::hsp60-RBSgp9-NanoLuc que permite el empaquetamiento in vitro en el fago lambda. Posterior a la transducción de E. coli y selección de los clones recombinantes, el ADN recuperado se empleó para transformar M. smegmatis mc2 155 y obtener playas de lisis.Luego de evaluar la funcionalidad del nuevo fago expresando la enzima NanoLuc, se obtuvo un stock de alto título (5x1012 UFP/mL) que se empleó para optimizar la infección de M. tuberculosis mc2 6230 en formato de microplaca de 96 pocillos. Se evaluaron las condiciones de cantidad de inóculo, multiplicidad de infección (MOI, relación fago/bacteria), tiempo de incubación con la droga y tiempo de infección óptimas para lograr la máxima señal luminiscente utilizando un luminómetro. Las mismas resultaron ser de 1x107 UFC a MOI 5, con un tiempo de 48 hs de preincubación con la droga y 48 hs infección con el fago. La relación Señal: Background (S/B) para el fago NanoLuc fue de 52:1 en comparación a una relación 5:1 obtenida previamente con los fagos reporteros fluorescentes, aumentando considerablemente la ventana activa del ensayo para la evaluación de drogas anti-tuberculosas.El nuevo fago NanoLuc podría convertirse en una poderosa herramienta para el HTS de drogas anti-TB en la industria farmacéutica. Actualmente, se están realizando ensayos con compuestos conocidos y sintetizados en nuestro grupo de investigación para evaluar su actividad, resultando ser de suma preeminencia la operatividad y rapidez en la obtención de una pronta respuesta, acortando los tiempos en la búsqueda de candidatos líderes.