Identificación de Sarcocystis spp. en jabalíes (Sus scrofa) del Noroeste Patagónico

HELMAN, E.; CHANG REISSIG, E.; DELLARUPE, A.; VENTURINI, M.C. ; MORÉ, G.

Río Cuarto - Córdoba

Congreso; XXII Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico; 2018

XXII Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

IntroducciónLa sarcocystosis es una infección parasitaria producida por una o más de las especies del género Sarcocystis. Los miembros de este género son protozoarios intracelulares del phylum Apicomplexa, pertenecientes a la familia Sarcocystidae. Presentan ciclos evolutivos indirectos produciendo quistes musculares por reproducción asexual en los hospedadores intermediarios (HI) y ooquistes con esporocistos por reproducción sexual en el intestino de los hospedadores definitivos (HD).La sarcocystosis porcina es una infección de distribución mundial causada por diferentes especies de Sarcocystis, que producen quistes en músculos de cerdos doméstico (Sus scrofa domestica) y jabalíes (Sus scrofa). Se han reportado 3 especies de Sarcocystis que afectan a los suinos como HI, las cuales tienen diferentes HD. Los cánidos, actúan como HD de S. miescheriana, los seres humanos de S. suihominis y los félidos de S. porcifelis (1). La presencia y validez de la especie S. porcifelis está en discusión (1). Los suinos se infectan por la ingestión de agua o alimentos contaminados con esporocistos eliminados en la materia fecal de los HD. Hasta el momento se han descripto diferentes tasas de infección en suinos con S. miescheriana y S. suihominis (2, 3, 4). Sin embargo, la prevalencia de sarcocystosis en suinos de Argentina es desconocida. La identificación y diferenciación de las especies de Sarcocystis se realiza mediante estudios morfológicos basados en el tamaño, grosor y estructura de la pared de los quistes y mediante estudios moleculares (1, 4). El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de quistes e identificar las especies de Sarcocystis spp. en muestras de músculos de jabalíes provenientes del noroeste de la Patagonia Argentina.Materiales y métodos Se obtuvieron muestras de músculos de 96 jabalíes cazados en estancias privadas de las provincias de Neuquén (NQ, n=79) y de Río Negro (RN, n=17). El muestreo abarcó 2 estancias de NQ (en Parque Nacional Nahuel Huapi y en un área próxima al Parque Nacional Lanín) y una de RN (en Pilcaniyeu). Las muestras se procesaron por homogeneización y observación microscópica en busca de quistes de Sarcocystis spp. (5). Para ello, se homogeneizaron 5 gr. de diafragma de cada animal con 50 ml de buffer de fosfato (PBS).Aquellas muestras en las que se observaron al menos 1 quiste de Sarcocystis spp. fueron consideradas ?positivas?. Los quistes o porciones de ellos fueron recolectados y observados al microscopio óptico y se realizó un registro fotográfico a 200 y 400 aumentos (Leica 2000). A su vez, los quistes fueron individualizados y se colocaron en microtubos de 1,5 ml (DNAsa free) para extracción de ADN y estudios de PCR y secuenciación. Se amplificó un fragmento del gen 18S rRNA, usando primers y protocolos descriptos previamente (5). En las muestras que resultaron positivas, se purificó el producto amplificado, y fue enviado para su secuenciación en ambos sentidos a la unidad de genómica, Instituto de Biotecnología CICVyA ? CNIA ?INTA, Argentina. Las secuencias se alinearon con el software GENEIOUS (versión R9). Las secuencias consenso obtenidas fueron analizadas y comparadas mediante BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).En aquellas muestras que presentaron numerosos quistes, se tomaron 10 o más para ser fijados en glutaraldehido al 2 % para microscopía electrónica de transmisión (MET), llevado a cabo por el Servicio Central de Microscopía Electrónica ?Shin-IchiItagaki? de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP.Las tasas de infección con Sarcocystis spp. entre las 2 provincias muestreadas se compararon estadísticamente mediante la diferencia de proporciones basada en la Distribución Beta, utilizando el paquete R Studio.ResultadosEl 46,88% (45/96) de las muestras analizadas resultaron positivas a la presencia de quistes de Sarcocystis spp. Todos los quistes observados presentaron paredes gruesas (< 3 µm).A su vez, el porcentaje de muestras positivas por observación microscópica fue 46,83% (37/79) y 47,05% (8/17) para NQ y RN, respectivamente. No se observaron diferencias significativas entre ambas provincias para la identificación de quistes en muestras de músculos de jabalíes (p>0.05). Se realizó PCR y secuenciación en quistes individualizados correspondientes a 4 muestras, obteniéndose 5 secuencias consenso de 817, 826, 832, 834, 661 pb., las cuales presentaron una homología mayor al 99% con otras secuencias de S. miescheriana reportadas previamente.Se procesaron quistes obtenidos de 4 muestras por MET. Se observó la ultraestructura de la pared de los quistes, con microvellosidades características de la especie S. miescheriana en todas las muestras y en 1 muestra se identificó 1 quiste con la ultraestructura propia de S. suihominis.Discusión y conclusiónLas tasas de infección con Sarcocystis spp. en las provincias de Neuquén y Río Negro fueron similares. Esto podría deberse a una distribución homogénea de casos en la región o a un cierto sesgo por el desbalance entre las cantidades de muestras obtenidas para cada zona. Los estudios sobre prevalencia de Sarcocystis spp. en jabalíes reportados a nivel mundial son escasos. Hasta el momento, se reportó una prevalencia del 25% en USA y del 72% en España (2,3). En este trabajo se obtuvo una prevalencia intermedia en comparación con estos países (46,88%). Por otro lado, considerando lo obtenido por MET y por PCR-secuenciación, se observó que S. miescheriana es la especie más prevalente lo cual concuerdan con lo descripto en la bibliografía consultada (2,3,4). Sin embargo, la presencia de la especie S. suihominis confirma el riesgo de infección para humanos, especialmente a través del consumo de carne cruda o insuficientemente cocida. Finalmente, se destaca la importancia de realizar un diseño balanceado que permita comparaciones entre diferentes regiones y ambientes ecológicos. Se propone realizar futuros estudios aumentando el tamaño muestral para establecer la prevalencia de las diferentes Sarcocystis spp. en suinos domésticos y silvestres de Argentina.