Construcción y utilización de un derivado recombinante del bacteriófago Qb como control interno en el diagnóstico por RT-PCR de virus con genoma ARN.

VILLANOVA, GABRIELA VANINA,; PEREZ GERMÁN; TABORDA, MIGUEL A.; GARDIOL, DANIELA; GIRI, ADRIANA

Buenos Aires

Congreso; Congreso internacional-GRUPO BIOTECNOLOGIA. VI Simposio internacional de Biotecnología- REDBIO Argentina 2005. Encuentro Trinacional REDBIO Argentina-Chile-Uruguay. BAIRESBIOTEC2005.; 2005

REDBIO Argentina; Grupo Biotecnología

Introducción. La aplicación de la técnica de RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN es muy utilizada en el diagnóstico clínico y la investigación. La inclusión de un control interno (CI) que permita verificar la eficiencia de todo el procedimiento es uno de los requisitos necesarios para la implementación de dichos métodos moleculares (Pasloske, B L et al, 1998). El desarrollo de un CI estable que funcione adecuadamente en tales aplicaciones se dificulta debido a la labilidad del ARN. El virus de la hepatitis C (HCV) es el principal causante de las hepatitis no-A no-B. HCV es un virus con genoma ARN (+) perteneciente a la familia Flaviviridae y se transmite principalmente por vía parenteral. El 75 % de los individuos infectados presentan infecciones crónicas que pueden progresar a cirrosis y hepatocarcinoma. Desde 1990, los países desarrollados han implementado métodos moleculares para la evaluación de los donantes lo que ha contribuido a disminuir la incidencia de la infección por HCV adquirida por vía transfusional (Moradpour, D et al. 2001). El objetivo de este trabajo fue el desarrollo de un CI competitivo estable (CIHCV) para su incorporación en un método de detección de HCV en plasma por RT-PCR y la ulterior estandarización del procedimiento. Para ello desarrollamos un bacteriófago Qb quimera para su uso como CIHCV. Qb es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qb). En nuestra estrategia el CIHCV se adiciona a la muestra para ser procesado y co-amplificado utilizando los mismos cebadores que para la detección de HCV (Figura 1). Metodología. Se introdujeron en el genoma fágico, los cebadores KY78 y KY80 (Young, K et al 1993), ampliamente usados para la detección de HCV. Dichos cebadores se clonaron dentro del marco de lectura de la proteína A1 de Qb, limitando un fragmento de 200 pb. Se sustituyó en Qb el fragmento salvaje correspondiente, obteniéndose el ADNc del genoma del fago modificado, pBRT7Qbr, que incluía las secuencias correspondientes a HCV flanqueando secuencias fágicas y clonado bajo control transcripcional del promotor T7 (Figura 2). pBRT7Qbr fue transformado en E.coli BL21 pLys S/DE3. Se largaron cultivos, se indujeron con IPTG y a partir de éstos se obtuvieron las partículas fágicas, CIHCV,  como descrito (Sambroock, J et al, 1989). La extracción de ARN a partir de 100 ml de plasma, incluyendo una dilución estandarizada de CIHCV, se realizó con tiocianato de guanidina, precipitación con alcoholes y resuspensión en 100 ml de agua libre de ARNasas. 34 ml de ARN fueron utilizados para la RT-PCR, con uno de los cebadores biotinilado en el extremo 5’(Figura 1). Los productos amplificados obtenidos a partir de HCV y del CIHCV, fueron detectados por hibridación con sondas específicas conjugadas a fluoresceína: 5 ml del producto de amplificación fueron hibridizados en fase líquida con cada una de las sondas en tubos separados. Los híbridos se capturaron en microplacas cubiertas con estreptavidina y se detectaron con un anticuerpo anti-fluoresceína y reacción colorimétrica. Resultados. El fago recombinante obtenido se ensayó en experimentos de infección de E. coli, los cuales demostraron su funcionalidad y viabilidad. Para confirmar los datos obtenidos in vivo, fue realizado un ensayo de RT-PCR a partir de los lisados de CIHCV usando los cebadores para HCV, KY78 y KY80. El fago recombinante obtenido fue resistente a ARNasa, estable al menos por 585 días a 4ºC y pudo ser co-amplificado satisfactoriamente en muestras HCV (+). Se estandarizaron las condiciones de RT-PCR para HCV incluyendo el CIHCV, para que la amplificación del virus diana no fuese  comprometida por la competencia entre los dos moldes. Además fue necesaria la optimización de la temperatura de hibridización para cada sonda, así como la concentración de sonda y del anticuerpo antifluoresceína en cada caso. La sensibilidad analítica estimada para este método molecular de diagnóstico de HCV fue de 5 copias por reacción. Conclusiones. Se logró el desarrollo de un CI específico y estable para la detección de HCV por RT-PCR. La estrategia utilizada para su construcción puede aplicarse a otros virus con genoma a ARN cuya detección sea de alto impacto clínico para la adopción de estrategias de prevención o terapéuticas. El ensayo aquí presentado cumple con los requisitos del Consenso Nacional Argentino de HCV, y su evaluación sería de utilidad para su uso en Bancos de Sangre de nuestro país. Bibliografía Moradpour D.; Cerny A.; Markus H.H. & Blum E.H. (2001). Swiss medical weekly, 131:291-298. Pasloske B.L.; WalkerPeach C.R.; Obermoeller R.D.; Winkler M. & DuBois D.B. (1998). Journal of Clinical Microbiology, 36, (12) : 3.590-3.594. Sambrook J.; Fritsch E. & Maniatis R. (1989) 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Young K.K.Y.; Resnick R.M. & Myers T.W. (1993) Journal of Clinical Microbiology, 31, (4) : 882-886. Agradecimientos. Este trabajo fue parcialmente financiado por Fogarty International Center, AIDS International Training Research Program-NIH (Subsidio Nº: 5 D43 TW001037).