In vivo detection of messenger arn molecules using crispr technology

SARMIENTO, ANDREA; ABIB, AGUSTINA; AGÜERO, TRISTAN

Congreso; XXXIX Sociedad de Biología de Tucumán; 2022

El desarrollo de un embrión es un proceso complejo, estrictamente regulado y coordinado para que cada célula y tejido pueda crecer de manera correcta y formar un organismo completo. Este proceso comienza mucho antes de la fecundación, mas precisamente durante la ovogénesis, donde se produce una acumulación de ARN mensajeros (ARNm), proteínas y mitocondrias en el citoplasma del ovocito. Este enriquecimiento de “contenido materno” es crítico para que el ovocito maduro sea fecundado y el cigoto resultante se desarrolle correctamente. Los transcriptos maternos acumulados se localizan en lugares precisos y determinados dentro del citoplasma. La correcta producción, agrupación y ubicación de ARNm son eventos clave para un desarrollo embrionario normal. En este trabajo desarrollamos una herramienta basada en tecnología CRISPR para visualizar ARNm in vivo. Construimos una proteína Cas13 híbrida que tiene sus sitios de corte de ácidos nucleicos inactivados por mutación y esta fusionada a una proteína reportera. Esto permite visualizar ARN mensajeros in vivo directamente en el embrión en desarrollo en tiempo real. Empleamos como modelo de trabajo embriones de Xenopus que tienen la ventaja de tener desarrollo externo y poseer un gran tamaño lo que facilita la observación de los ARNm blanco. Los resultados demostraron la presencia de fluorescencia en los dominios de expresión de la helicasa mov10 en las células germinales primordiales y del factor de transcripción Yy1 en placa y pliegues neural. Esta técnica innovadora permite realizar un análisis genuino y creíble de lo que sucede en un ambiente dinámico y complejo como es una célula viva y particularmente un embrión en desarrollo.