Enzimas vegetales capaces de degradar colágeno y queratina

ERRASTI MARÍA EUGENIA; DE ARAUJO VIANA, CAROLINA; TORRES, MA.JOSÉ; PROSPITTI, ANABELA; NATALUCCI, CLAUDIA LUISA; CAFFINI NÉSTOR; VIANA RAMOS, MARCIO; LÓPEZ, LAURA MI

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO 2014); 2014

Universidad Nacional del Litoral

Introducción Las enzimas son catalizadores biológicos que, a diferencia de la mayoría de los catalizadores no biológicos, poseen un grado alto de especificidad de sustrato y actúan en soluciones acuosas en condiciones muy suaves de temperatura y pH1. El Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) recomendó el uso del término peptidasa para designar a las enzimas hidrolíticas que degradan enlaces peptídicos2. Las peptidasas representan casi las dos terceras partes de las enzimas que se comercializan en el mercado mundial. La mayor parte de estas enzimas provienen de fuentes microbianas, pero varias peptidasas vegetales tales como papaína, bromelina y ficina, siguen siendo irreemplazables en un gran número de procesos3,4. Si bien todas las peptidasas conocidas catalizan la misma reacción (la hidrólisis de la unión peptídica) difieren ampliamente en su especificidad en el tipo de unión peptídica susceptible de ser hidrolizada, así como en sus características cinéticas y estructurales. Las peptidasas capaces de degradar colágeno y queratina representan una herramienta biotecnológica de gran interés para su empleo en la industria del cuero, alimentaria y farmacéutica. El desarrollo de un proceso de depilación enzimático está produciendo en la industria curtidora mundial un gradual reemplazo de las tecnologías tradicionales5. Las peptidasas con actividad colagenolítica también son aplicadas para la limpieza y cicatrización de heridas, quemaduras y úlceras. Además, en la producción de alimentos y en otros procesos industriales se generan grandes cantidades de proteínas de desecho, algunos de estos materiales pueden ser tratados empleando enzimas con actividad de colagenasa y queratinasa para poder ser aprovechados y empleados en la elaboración de alimentos balanceados para animales o incluso para el hombre (Walsh, 2002). 1 (Lodish et al., 2004 2 (Barrett et al., 2004a). 3 Mantell, S.H., J.A. Matthews & R.A. McKee (1986) "Principles of plant biotechnology", Blackwell Sci.Pub., Oxford, pp. 207-12 4 Uhlig, H. (1998) "Industrial enzymes and their applications", John Wiley & Sons, Inc., USA. 5 Cantera C., and J. Buljan (1997) "Overview: hair -a new raw material", World Leather 10: 51-6 Metodología Material vegetal/Enzimas Los materiales vegetales estudiados son producto de compromisos de cooperación científica establecidos entre grupos de investigación pertenecientes a Universidades Nacionales y a la Universidad Federal de Ceará, Brasil. Se han incluido las siguientes especies: Bromelia balansae Mez, Bromelia hieronymi Mez y Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae), Phytolacca dioica L. (Phytolaccaceae), Vasconcellea quercifolia A.St.-Hil (Caricacea), Calotropis procera Aiton, Cryptostegia grandiflora R. Br. y Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum. (Apocynaceae). En el caso de las especies con látex, el mismo fue obtenido practicando incisiones del órgano vegetal que lo contenga, el látex exudado fue recogido sobre agua ó un buffer apropiado conteniendo sustancias protectoras, manteniendo la temperatura entre 0°C y 4°C y clarificado mediante centrifugación. En el caso de las peptidasas que se encuentran localizadas en frutos, los extractos crudos fueron obtenidos procesando del material vegetal a 0-4°C en un homogeneizador en presencia de buffer conteniendo protectores de la actividad enzimática6. Los restos vegetales fueron eliminados por centrifugación. En todos los casos las preparaciones enzimáticas obtenidas fueron caracterizadas y liofilizadas. 6 Pardo, M.F., L.M.I. López, F. Canals, F.X. Avilés, C.L. Natalucci, & N.O. Caffini (2000). "Purification of Balansain I, an Endopeptidase from Unripe Fruits of Bromelia balansae Mez (Bromeliaceae)". Journal of Agricultural and Food Chemistry 48: 3795-800 Ensayos de actividad enzimática Para la determinación de las actividades enzimáticas se emplearon sustratos sintéticos cromogénicos. Azul de polvo de piel (HPA): preparado rico en colágeno. Para el desarrollo del protocolo de actividad enzimática se utilizaron 10 mg del substrato Hide-Remazol Brilliant Blue R (H6268 Sigma) suspendido en 3,8 ml de buffer Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) al cual se adicionó 200 μl de la solución del producto enzimático. La reacción se llevó a cabo en un baño termostatizado con agitación continua a 37 ºC durante diferentes tiempos, luego se centrifugó a 3500g durante 5 minutos y se midió la absorbancia a 595 nm. Se definió la "unidad de actividad HPA - UHPA -" como la cantidad de enzima que, en las condiciones del ensayo, produce un cambio en 0,001 unidad de Abs595 por hora. Azul de queratina (lana tintada): este sustrato es usado para determinar la actividad queratinolítica de los preparados enzimáticos. El ensayo se realizó empleando el sustrato keratin azure (K8500 Sigma) siguiendo un procedimiento similar al indicado para el sustrato HPA. Se definió la "unidad de actividad queratinolítica -UKer-" como la cantidad de enzima que, en las condiciones del ensayo, produce un cambio en 0,001 unidad de Abs595 por hora. Resultados y conclusiones La actividad por mg de producto se muestra en la figura para cada uno de los extractos enzimáticos de origen vegetal y para la enzima comercial (New 1875, Cergen) que se utiliza en la tecnología del cuero y fue testeada con fines comparativos. Todas las preparaciones enzimáticas de origen vegetal ensayadas fueron capaces de hidrolizar colágeno pero en diferente grado, siendo las más activas las obtenidas a partir de frutos B. hieronymi y del látex de V. quercifolia que mostraron actividades de 9500 y 8500 UHPA por mg de producto liofilizado, respectivamente. Dichas actividades fueron significativamente mayores que la actividad determinada para la preparación comercial (3400 UHPA por mg de producto). 020004000600080001000012000BhBbPmPdNew1875VqCpCgTpActividad colagenolítica050100150200250300350400450500Actividad queratinolíticaActividad colagenolítica (UHPA/mg)Actividad queratinolítica (UKER/mg) En cuanto a la hidrólisis de queratina las actividades fueron menores, destacándose las preparaciones obtenidas a partir del látex de C. grandiflora y de C. procera con actividades de 470 y 200 Uker por mg de producto, respectivamente. Valores que nuevamente fueron significativemente mayores al determinado para la enzima comercial (32 Uker por mg de producto). Las preparaciones enzimáticas que manifestaron mayor actividad resultan ser muy promisorias como fuentes de enzimas con actividad colagenolítica y/o queratinolínica. Por otra parte la caracterización de las actividades enzimáticas de la especies vegetales estudiadas sienta las bases para la formulación de preparaciones multienzimáticas.