Producción de Factores de Crecimiento Recombinantes utilizando biorreactores vegetales

MÜLLER, CAROLINA; MIRKIN, FEDERICO G.; PEREZ CASTRO, CAROLINA; WIRTH, SONIA A.; SEGRETIN, MARÍA EUGENIA

La Plata

Taller; Taller en Molecular Farming; 2019

Los factores de crecimiento son proteínas de señalización que regulan procesos de división y diferenciación celular, y son necesarios para el mantenimiento in vitro de líneas celulares con propiedades de células madre. El objetivo del presente trabajo es evaluar la producción de factores de crecimiento recombinantes en dos sistemas de expresión basados en biorreactores vegetales: expresión estable en plantas transplastómicas de Nicotiana tabacum, y expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. En primer lugar, se evaluó la transformación del genoma plastídico para expresar el Factor de Crecimiento Fibroblástico (hbFGF); este sistema se eligió debido a la potencialidad para alcanzar altos niveles de expresión de proteínas heterólogas. La secuencia codificante de hbFGF se clonó en un vector de transformación plastídica y se transformaron hojas de N. tabacum por biobalística. La naturaleza transplastómica de los brotes regenerantes se analizó mediante PCR, corroborando la integración del transgén. Las líneas obtenidas fueron sometidas a sucesivas rondas de regeneración para alcanzar la homoplastia y posteriormente rusticadas. Mediante la técnica de western blot, fue posible detectar la presencia de la proteína hbFGF en plantas de primera ronda de regeneración rusticadas. Por otro lado, se evaluó la expresión y acumulación de hbFGF en distintos compartimentos subcelulares utilizando un sistema de expresión transitoria en N. benthamiana. Se adaptó el vector de expresión transitoria pEAQ para hacerlo compatible con el sistema de clonado Golden Gate Assembly. El vector adaptado permite el clonado modular de proteínas recombinantes fusionadas a diferentes señales de localización subcelular y fue utilizado para clonar distintas versiones de hbFGF, dirigiendo su expresión a citoplasma, apoplasto, retículo endoplasmático y vacuola. Se agroinfiltraron plantas de N. benthamiana con las distintas construcciones y se evaluó la expresión de hbFGF por western blot, observándose expresión de la proteína recombinante en apoplasto y en retículo endoplasmático. En conclusión, los dos sistemas estudiados permiten expresar la proteína recombinante hbFGF. Una vez optimizados los niveles de expresión será posible determinar cuál es el sistema más adecuado para la producción de esta proteína recombinante. A su vez, el sistema de expresión transitoria en N. benthamiana resulta versátil para el estudio de expresión de otros factores de crecimiento recombinantes.