Uso de MALDI-TOF MS para la evaluación de resistencia a carbapenemes mediante la detección de variantes de KPC y uso de un biomarcador para detectar la resistencia a colistina por MCR-1

FIGUEROA ESPINOSA ROQUE A; GUTKIND GABRIEL; DI CONZA JOSÉ

Capital Federal

Taller; VIII taller de la Red Nacional de Espectrometría de Masas aplicada a la Microbiología Clínica; 2022

RENAEM

La combinación de ceftazidima/avibactam (CZA) representa una de las pocas alternativas para el tratamiento de las infecciones por bacterias gram negativas productoras de serino-carbapenemasas. Así mismo, colistina sigue siendo una de las últimas alternativas para el control de infecciones por bacterias multirresistentes, a pesar de las contraindicaciones y las consideraciones que se deben tomar para la instauración de un esquema terapéutico. Las pruebas de diagnóstico rápido para detectar bacterias resistentes a los carbapenemes y colistina son de importancia para definir tanto una terapia antibiótica temprana, como escenarios epidemiológicos y prevenir posibles eventos de diseminación. Sin embargo, estos métodos, en general, no diferencian variantes de KPC, algunas de las cuales están asociadas a la resistencia a CZA. Por otra parte, las metodologías para detección de resistencia a colistina requieren de métodos alternativos con tiempo prolongados de incubación Nos propusimos detectar y diferenciar la producción de distintas variantes de KPC en enterobacterias. Adicionalmente, evaluamos la presencia de un biomarcador previamente caracterizado, HicA (pico 6550 Da), para la detección temprana de la resistencia a la colistina mediada por MCR-1, utilizando MALDI-TOF MS.Para la detección de las variantes de KPC se incluyeron un total de 80 aislamientos clínicos resistentes a carbapenemes: 50 cepas productoras de KPC-2 [K. pneumoniae (45), E. coli (3), S. marcescens (2)] y 30 K. pneumoniae, de las cuales 20 son productoras de KPC-3 y 10 son resistentes a CZA por producción de KPC-31 (5), KPC-8 (1) o NDM-1 (4). Cepas recombinantes para blaKPC-2, blaKPC-3, blaKPC-8 y otra electroporante para blaKPC-2 fueron usadas para definir el pico correspondiente a la proteína madura de la enzima. Las cepas receptoras, K. pneumoniae ATCC 700603 y otras productoras de NDM se usaron como controles negativos (20).El equipo fue calibrado con un estándar propio del método (poner cual es). La adquisición de los espectros se realizó a partir de colonia posterior a la extracción de proteínas con solvente orgánico en el rango de 17.000-50.000 Da usando la matriz de ácido sinapínico. La detección de picos y construcción de los modelos se realizó emplando los softwares flexAnalysis y ClinProTools. El análisis visual de los espectros permitió identificar 4 picos de mediana intensidad en diferentes posiciones con relación a su m/z, para las variantes KPC-8, KPC-2, KPC-3 y KPC-31, respectivamente. Usando el algoritmo “Supervised Neural Network” se generó un modelo de análisis independiente para cada una de las variantes de KPC, pudiendo clasificar los aislamientos con una sensibilidad y especificidad del 100%.Para la identificación del biomarcador HicA correpondiente al pico de 6650 Da se analizaron espectros de 95 aislamientos clínicos humanos de E. coli previamente caracterizados: 25 resistentes a colistina por producción de MCR-1 y 70 sensibles a colistina (algunos de los cuales son resistentes a otros antibióticos). Como controles se usaron: una cepa recombinante para el sistema toxina antitoxina hicAB y dos cepas de E. coli productoras de MCR-1 transconjugantes. Para la identificación del biomarcador HicA, cada aislamiento se procesó simultáneamente según dos protocolos: a- desde colonia, b- método de extracción en tubo. El análisis se realizó en el rango de identificación (2.000-20.000 Da) con matriz HCCA. Cuando se procesaron los aislamientos clínicos, se detectó el pico de interés en aquellos productores de MCR-1 (el área bajo la curva ROC fue de 0,99). Utilizando el método de extracción en tubo, la sensibilidad y la especificidad fue del 100%, mientras que a partir de colonia la sensibilidad fue del 86% y especificidad del 100%.Estos resultados preliminares sugieren que MALDI-TOF MS podría ofrecer una alternativa metodológica para la detección rápida y discriminación entre las dos variantes de KPC de mayor circulación a nivel mundial (KPC-2 y KPC-3). También se logra diferenciar variantes de KPC (KPC- 8 y KPC-31) que confieren resistencia a CZA reportadas recientemente en Argentina. Por otra parte, la visualización del pico de c.a 6650 Da podría ser un método rápido para predecir la resistencia a la colistina mediada por MCR-1 en aislamientos de E. coli, en la medida en que las plataformas de plásmidos se conserven.