EVALUACIÓN DE UNA CÁMARA DE HIPOXIA PARA SU APLICACIÓN EN ESTUDIOS DE ISQUEMIA / REPERFUSIÓN

ALFARO MAIARA A; JUAN DE PAZ L.; ROBERT, MARIA CELESTE

Rosario

Jornada; Jornadas de Ciencia, Tecnología e Innovación 2022; 2022

UNR

El daño cerebral por isquemia/reperfusiòn es de gran interés clínico, ya que se encuentra asociado con varias condiciones patofisiológicas. El estudio in vitro, mediante cultivos neuronales en cámaras de hipoxia es una gran herramienta para la investigación de los efectos celulares y moleculares asociados a los procesos isquémicos. La necesidad de contar con una cámara de hipoxia, económica, y confiable condujo al desarrollo, por parte del CAIC, de un modelo para ser utilizado en incubadoras estándares de laboratorio, con los materiales disponibles en el mercado local. Cada cámara se construyó con un recipiente de PVC colocado de manera invertida (tapa sobre la mesada), al cual se le agregaron dos llaves de PVC de dos vías con válvula reguladora que permiten: a- el ingreso de la mezcla de gases deseada (95% N2/5% CO2) y b- purgar el contenido de gases de la cámara. Con el fin de caracterizar la estanquedad de la cámara, y los tiempos necesarios para lograr las condiciones de hipoxia deseadas, se realizaron estudios sobre la concentración de O2 en diferentes condiciones. En función de los resultados obtenidos en esta etapa, se diseño un protocolo de tratamiento para la inducción del daño por hipoxia en células neuronales Neuro2a. El mismo fue evaluado durante distintos tiempos mediante estudios de viabilidad celular por el ensayo de MTT. El tiempo de purgado necesario para alcanzar una reducción del 90% de la presión parcial de O2 fue 1.8 ± 0.2 min (n=3) por lo que se decidió utilizar 3 veces dicho tiempo para garantizar un ambiente de hipoxia adecuado. Transcurridas 24 horas luego del purgado, la presión parcial de O2 se mantuvo por debajo del 4% (3.8 ± 0.3, n = 3, Temp = 25 °C) confirmando la adecuada estanquedad de la cámara. Asimismo se evaluó la pertinencia de una etapa de burbujeo del medio de cultivo (MEM) con la mezcla de gases deseada, demostrando que para tiempos de hipoxia mayores a una hora, este paso no sería necesario. A partir de las determinaciones de la actividad mitocondrial de cultivos de Neuro2a se comprobó que a tiempos de hipoxia menores de 4 horas no se observan diferencias respecto al control; mientras que si se observan luego de 24 horas de hipoxia. Estos datos deben ser completados mediante la evaluación de tiempos intermedios (entre 4 y 24 horas) para una correcta caracterización del daño producido por las condiciones de hipoxia.