Caracterización de la línea celular de granulosas ováricas bovinas BGC-1: detección de diferentes marcadores de funcionalidad

CATTANEO MOREYRA, ML; ETCHEVERS, L; STASSI, AF; CHIARAVIGLIO, JA; VILLALBA, L; AMWEG, AN; ORTEGA, HH; SALVETTI, NR; RODRIGUEZ, FM; REY, F

Encuentro; IX Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2021

En el período posparto temprano de las vacas lecheras ocurre un rápido aumento de los requerimientos nutricionales, que no alcanza a ser cubierto mediante la ingesta. Éste aumento de los requerimientos de nutrientes necesarios para la lactancia provoca un desequilibrio energético durante el período posparto temprano que puede durar varias semanas después del parto3. En este contexto, se genera un aumento de la lipomovilización, la gluconeogénesis y la oxidación de ácidos grasos. Consecuentemente incrementan las concentraciones de ácidos grasos no esterificados y β-hidroxibutirato circulantes, para ser utilizados como fuente energética alternativa de los tejidos no mamarios y direcciona la glucosa hacia la glándula mamaria. Frente a esta situación, se desvían los nutrientes y afecta a la reproducción2, limitando el número de folículos ováricos, el crecimiento y el tamaño máximo del folículo dominante, retrasa la primera ovulación e interfiere con el proceso ovulatorio. En ese sentido, se ve favorecido el destino del folículo dominante hacia la persistencia folicular y posible desarrollo de la enfermedad quística ovárica (COD; del inglés Cistyc ovarian disease). En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo de persistencia folicular en bovinos lecheros que consiste en la administración de dosis subluteales de progesterona (P4) utilizando un dispositivo intravaginal1. En este modelo in vivo se determinó que el tratamiento con P4 inhibe el pico preovulatorio de hormona luteinizante (LH) en las vacas tratadas y altera los niveles de 17β-estradiol (E2), P4, 17-hidroxiprogesterona y testosterona en suero y líquido folicular, similar a lo observado en vacas con COD. Para ampliar los conocimientos que determinan una persistencia folicular, nos propusimos determinar la expresión de distintos marcadores relacionados con la esteroidogénesis, como indicadores de funcionalidad ovárica, en las células de la granulosa. En este sentido los análisis in vitro de cultivos celulares son útiles para complementar los resultados del modelo in vivo. Para ello, nos plantemos como objetivo determinar la presencia de: la enzima citocromo P450 aromatasa (CYP19), 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3β-HSD), el receptor de progesterona (PR), y receptores de estrógenos (ERα y ERβ) en la línea de células de la granulosa bovina BGC-1. Las células provenientes de una línea celular de la granulosa bovina (BGC-1), cedidas por el Dr. Lino Barañao del Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME, CONICET), se cultivaron en un medio DMEM:F12 (Gibco) completo (suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de antibiótico). Al alcanzar el 80% de confluencia en un frasco T25, se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer con el colorante de exclusión azul de Tripán. En placas de 24 pocillos, se sembraron pocillos con 100.000 y 50.000 células y se incubaron por 24 y 48 h respectivamente. Las células se trataron con diferentes concentraciones de gonadotropina sérica de yegua gestante (PMSG, del inglés pregnant mare's serum gonadotropin): 1, 5 y 10 UI/ml. Se incorporaron controles sin PMSG en los tiempos estudiados. Una vez finalizado el ensayo, se retiró el medio de cultivo y se colectaron las células. Para ello, previamente se lavaron con 200 µl de buffer fosfato salino (PBS) y se trataron con 100 µl de tripsina a 37°C y deteniendo la rección con 200 µl del medio de cultivo completo. Las células se centrifugaron y el pellet de células obtenido se resuspendió en 400 µl de PBS. Luego las células fueron adheridas a portaobjetos mediante centrifugación (citocentrífuga Cyto-Tek Sakura), para realizar posteriormente la técnica de inmunocitoquímica indirecta. Para ello, las células (100 µl/portaobjetos) se fijaron en metanol frío y, luego, se permeabilizaron con tritón. A continuación, se incubaron con los anticuerpos primarios como se indica en la tabla 1, durante toda la noche a 4 °C. Como control negativo se omitió el anticuerpo primario, realizándose la incubación con una solución de PBS y albúmina sérica bovina (PBS-BSA) durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit comercial compuesto por anticuerpos polivalentes biotinilados y estreptavidina marcada con peroxidasa (CytoScan HRP Detection System, Cell Marque) y se utilizó como cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB, Thermo Fisher Scientific). Luego, las células se contracolorearon con hematoxilina y se realizó el montaje con cubreobjetos. Se obtuvieron imágenes de los preparados citológicos que fueron digitalizadas mediante una cámara color de video CCD (Motic 2000, Motic China Group, China) montada a un microscopio de luz convencional (Olympus BH2, Olympus Co., Japan).Estos resultados nos permitirán avanzar con los cultivos de las células BGC-1 frente a distintos estímulos relacionados al metabolismo de lípidos capaces de alterar la funcionalidad de los folículos, como la esteroidogénesis, útiles para comprender mecanismos relacionados a la persistencia folicular y complementar los resultados del modelo de persistencia in vivo.