Validación del ensayo de LINA para la detección cualitativa temprana del Virus SARS-CoV-2, causante de COVID-19

BARRERA, GI; TALIA, JM; LACAZE, MA; ROSALES, E; AGUILERA, L; FERNÁNDEZ, JG; MARINO C; FERNÁNDEZ BALDO, MA; RINALDI TOSI, ME

Mendoza

Encuentro; 4to Encuentro de Investigadores de la Red Andina de Universidades; 2022

Red Andina de Universidades

El reciente brote del nuevo Virus Corona (SARS-CoV-2), causante del Síndrome RespiratorioAgudo Grave (SARS) y designado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como laenfermedad de COVID-19, ha generado una gran preocupación global, dada su rápidapropagación, en varios países alrededor del mundo y la posible progresión fatal de esta infección.Por tal motivo, el diagnóstico rápido y preciso, ha sido uno de los factores determinantes paracontrolar la rápida propagación del virus y el aislamiento temprano de los pacientes. El elevadocosto del servicio, sobre todo por sus reactivos y equipamiento importado, restringe el diagnósticosolo unos pocos laboratorios especializados, disminuyendo la posibilidad de realizar el mismo deforma masiva y descentralizada en centros de baja y mediana complejidad, a un costo accesible yen menor tiempo. Por tal motivo, nuestro objetivo fue desarrollar y optimizar un ensayo de LINA(siglas del inglés Loop Isothermal Novel Assay), que presenta ciertas ventajas frente a los métodosdiagnósticos tradicionales, ya que resulta más simple, rápido, temprano, económico y versátil,manteniendo la especificidad y una alta sensibilidad característica de las técnicas genómicas. Deesta manera, el objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar una metodología diagnostica, parala detección temprana del virus SARS CoV-2 utilizando técnicas genómicas de amplificaciónisotérmica. Para este trabajo, se diseñaron cebadores de reconocimiento específicos para 3 genesdel virus (genes E, N y Orf1ab) y también un gen control (RNasa P). Para el ensayo de verificaciónse utilizaron un total de 19 Muestras del biobanco del laboratorio de salud pública de la provinciade San Luis. Las muestras de ARN fueron purificadas de forma automatizada utilizandoequipamiento Marca: BIOER Modelo: GenePure Pro 32 y analizadas previamente por método deamplificación genómica de Reacción en Cadena de Polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)estandarizadas en una reacción dúplex usando cebadores para la detección simultanea de SARSCoV-2 (gen E) y un control interno (RNAsa P humana) (canal FAM: 470-510nm y Cy5: 610-670nm, respectivamente). Todas las muestras fueron obtenidas previamente de hisopadosnasofaríngeos, caracterizadas como muestras Positivas y Negativas y el material genómicoconservado en ultrafreezer a -80°C. De las 19 muestras totales, 1 fue utilizada como controlnegativo y las 18 restantes fueron utilizadas como controles Positivos para el ensayo. Además, seutilizó un control de reactivos NTC (No template control) sin el agregado de la muestra, utilizandoagua ultra pura en su reemplazo. Nuestros resultados demostraron que de las 18 muestras positivas evaluadas 11 (61,11%) reconocieron a los 3 genes estudiados, 5 muestras (27,77%) reconocieron 2 de los genes, y 2 muestras (11,11%) reconocieron al menos 1 gen del Virus. Teniendo en cuenta la totalidad de los ensayos y controles realizados, el método presentó una efectividad del 88,75% de los genes evaluados de forma individual y del 100% evaluados de manera conjunta. Concluimos que todas las muestras positivas estudiadas (100%) fueron capaces de reconocer al menos 1 de los 3 genes del Virus estudiados por lo que este ensayo resulta un candidato idóneo para el desarrollo de un kit diagnóstico.