EVALUACION DE LA CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE NANOPARTÍCULAS DE SOLUPLUS ® ASOCIADAS A IgG O FRAGMENTOS Fab SOBRE LA CITOTOXICIDAD DE LA TOXINA SHIGA TIPO 2

GIRON REYES, CLAUDIO DANIEL; GOMEZ, FERNANDO DANIEL; AMARAL, MARIA MARTA; LUZ, DANIELA; HENRIQUE, IZABELLA DE MACEDO; IBARRA, CRISTINA; PIAZZA FONTES, ROXANE MARIA; CHIAPPETTA, DIEGO; MORETTON, MARCELA; SACERDOTI, FLAVIA

Workshop; Fronteras en Nanobiotecnologia III; 2022

Facultad de Farmacia y Bioquimica UBA

La toxina Shiga tipo 2 (Stx2) es el principal factor de virulencia de Escherichia coli productorde toxina Shiga (STEC) y es responsable de desencadenar el Síndrome Urémico Hemolítico(SUH). Dado que el SUH aún no dispone de un tratamiento específico, proponemos quenanopartículas (NP) acopladas a anticuerpos, pueden ser una buena herramienta comotratamiento preventivo al aumentar la biodisponibilidad y reducir la degradación sistémica delcomponente bioactivo.El objetivo de este trabajo fue desarrollar y caracterizar NP de Soluplus® acopladas a IgG yfragmentos Fab recombinantes contra la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) y comparar su capacidadneutralizante de la toxina in vitro.Las IgG anti Stx2 (IgG-Stx2) se purificaron de calostro bovino hiperinmune y los fragmentosFab (Fab-Stx2) específicos se obtuvieron por tecnología de phage display y se purificaron porcolumna de afinidad.Las NP de Soluplus® se prepararon al 5% en PBS en agitación por 24 hs a temperaturaambiente. El acoplamiento a las NP con las IgG (NP-IgG-Stx2 o NP-IgG-Control) o Fab (NP-Fab-Stx2) se realizó agregando los anticuerpos en las relaciones molares de 1:100 (NP:IgG)y 1:240 (NP:Fab). Se caracterizó la morfología y el radio hidrodinámico de las NP con y sinanticuerpos mediante microscopia electrónica de trasmisión (MET) y dispersión de luzdinámica (DLS).Para los ensayos de neutralización de Stx2 se realizaron diluciones seriadas al medio de lasNP-IgG-Control, NP-IgG-Stx2, NP-Fab-Stx2 o IgG-Stx2 y Fab-Stx2 en medio de cultivo (MEM)y se coincubaron con una CD50 de 4ng/ml de la toxina por 30 minutos. Luego, la mezcla secolocó sobre células Vero por 72 hs y finalmente se calculó el % de viabilidad celular conresarzurina.Los análisis de MET mostraron una morfología circular en las NP con un diámetro aproximadode 100 nm, cuyo tamaño y morfología se conservaron luego de su asociación con las IgG.Mediante la técnica de DLS se observó un radio hidrodinámico sin diferencias estadísticassignificativas entre las NP y las NP-IgG-Stx2, NP-IgG-Control y NP-Fab-Stx2 (71,30 ± 2,10;92,38 ± 18,51; 111,8 ± 32,49; 115,7 ± 56,00 nm respectivamente), demostrando un buenacople entre la NP y los anticuerpos.Las NP no mostraron citotoxicidad a ninguna de las diluciones utilizadas sobre las célulasVero. Por otra parte, las NP-IgG-Stx2 mantuvieron la capacidad neutralizante de manera dosisdependiente sobre Stx2 con respecto a IgG-Stx2 (ANOVA de dos vías, p> 0.05).Por otro lado, las células Vero tratadas con las NP-Fab-Stx2 tuvieron una viabilidad menor(una diferencia de viabilidad en promedio 24% considerando todas las diluciones realizadas,ANOVA de dos vías, p< 0,05) con respecto a las tratadas con Fab-Stx2.Los resultados obtenidos muestran que la asociación de las NP de Soluplus® con las IgGbovinas mantiene la propiedad de neutralización de los anticuerpos contra Stx2. Sin embargo,al acoplar NP Soluplus® a los fragmentos de Fab no se conservaron sus propiedadesneutralizantes contra la toxina. Esto abre la perspectiva de continuar el estudio hacia unamejora en el entendimiento de la asociación de los anticuerpos a las NP de Soluplus®.