DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE GLUCOSA Y GLICEROL COMO INDICADORES DE LA DINÁMICA DE FERMENTACIÓN EN KÉFIR DE AGUA OBTENIDO MEDIANTE UN MINIBIORREACTOR LAB-MADE

MARILINA LANG; MARÍA BELÉN PÉREZ ADASSUS; SEBASTIÁN COSTA; MARCOS GRUNHUT; VERÓNICA VOLPE; VERÓNICA LASALLE

Corrientes

Congreso; XI Congreso Argentino de Química Analítica; 2021

AAQA

El kéfir de agua es una bebida fermentada obtenida por el agregado de nódulos de kéfir (inóculo) a una mezcla de agua y azúcar. El proceso fermentativo puede ser monitoreado a partir de la cuantificación de los diversos sustratos y metabolitos generados en dicho proceso, lo que suele llevarse a cabo mediante el empleo de técnicas cromatográficas (HPAEC-PAD, GC-FID)1. Sin embargo, dichas técnicas son costosas, poco amigables con el medio ambiente y además no permiten obtener información en tiempo real debido a los largos tiempos de análisis. Este trabajo propone evaluar la dinámica de fermentación en muestras de kéfir de agua mediante una secuencia de reacciones enzimáticas para la determinación espectrofotométrica de glucosa (sustrato) y glicerol (metabolito). Las enzimas involucradas fueron inmovilizadas en nanopartículas de óxido de zinc (ZnO-NPs). Por otro lado, se diseñó y desarrolló en el laboratorio un minibiorreactor para controlar de forma precisa las variables involucradas en la obtención de la muestra.Métodos. El minibiorreactor (Fig. 1) consta de un reactor de vidrio de color caramelo (100 mL) el cual descansa sobre una placa calefactora de cerámica (12 cm2). La agitación se realiza a través de una paleta de acero inoxidable impulsada por un motor colocado en la parte superior. El dispositivo se desarrolló empleando electrónica Arduino y permite el control de temperatura, velocidad y tiempo de agitación. Las muestras de kéfir de agua se obtuvieron por agregado de 5 g de azúcar mascabo, 25 g de nódulos y 80 mL de agua en el minibiorreactor. La mezcla se incubó a 35°C, con ciclos de agitación de 10 min cada hora y durante 12, 24 y 48 h. Luego, las muestras fueron conservadas en heladera a 4 °C. La determinación de glucosa se basó en la reacción secuencial de la misma con glucosa oxidasa (GO) y peroxidasa (PO) lo que promueve la oxidación del clorofenol con la 4-aminofenazona dando lugar a un complejo que absorbe radiación a 505 nm. La determinación de glicerol se basó en la reacción secuencial de glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GFO) y PO promoviendo la reacción final antes descripta. La inmovilización de enzimas en nanopartículas de ZnO (Z=13,50±0,21; PdI=0,575) se realizó modificando previamente la superficie de las mismas con cisteína y glutaraldehído (25%). Finalmente, se agregaron las enzimas (GO+PO o GK+GFO+PO) a las nanopartículas modificadas, se centrifugó a 6000 rpm durante 4 min y se realizaron lavados sucesivos con buffer fosfato2.Resultados. El minibiorreactor permitió estandarizar la obtención de kéfir de agua mediante el control de las condiciones durante el proceso fermentativo (temperatura, tiempo y velocidad de agitación). GO+PO (glucosa) y GK+GFO+PO (glicerol) fueron, en cada caso, simultáneamente inmovilizadas en ZnO-NPs de manera exitosa. El estudio a diferentes tiempos de fermentación mostró una clara tendencia de consumo de glucosa acompañado por la generación de glicerol, un metabolito típico del proceso fermentativo.Conclusión. La inmovilización simultánea de las diferentes enzimas en ZnO-NPs permitió disminuir significativamente el consumo de dichos biocatalizadores y de reactivos implicados en la reacción. El minibiorreactor fue construido con materiales accesibles, una electrónica sencilla y un costo significativamente menor a lo disponible en el mercado. La determinación de glucosa y glicerol permitió evaluar exitosamente la dinámica del proceso fermentativo en la obtención de una bebida con un marcado aumento en su tendencia de consumo. 1.D., Aerts, M., Vandamme, P., & De Vuyst, L. (2018). Food Microbiology, 73 ,351-361.2.Batool, R., Kazmi, S.A.R., Khurshid, S., Saeed, M., Ali, S., Adnan, A., Altaf, F., Hameed, A., Batool, F., Fatima, N., Batool, R., & Fatima N. (2022). Food Chemistry, 366, 130591. Agradecimientos. Los autores agradecen a la Universidad Nacional del Sur (PGI 24Q117) y a CONICET.