Generación de deleciones en GGTA1 en embriones porcinos asistida por CRISPR-Cas9 como ADN o como complejo (proteína y ARN)

GE LA MOTTA; O BRISKI; LD RATNER; DF SALAMONE; R FERNANDEZ-MARTIN

Congreso; XIII Simposio RedBio Argentina 2021; 2021

red bio argentina

La aparición de CRISPR-Cas9, una herramienta molecular que facilita introducirvarias modificaciones genéticas en simultáneo, ha permitido el resurgimiento dela idea del xenotrasplante como solución para los pacientes en las crecienteslistas de espera. Por sus similitudes fisiológicas y facilidades de manejo, el cerdoes el donante elegido. Sin embargo, se requieren varias modificaciones en sugenoma para evitar el rechazo inmunológico implicado. El primer paso es lainterrupción del gen α-1,3-galactosiltransferasa (GGTA1), cuya actividad colocaresiduos de galactosa en las superficies de las células porcinas. Estos residuos,ausentes en células humanas, son los principales responsables del rechazohiperagudo, ya que están presentes en bacterias con las que convivimos, por loque tenemos anticuerpos preformados. En este ensayo comparamos laeficiencia de edición del sistema CRISPR-Cas9 introducido como plásmidos(grupo ADN), o como complejo ribonucleoproteico (grupo RNP) en embrionesporcinos partenogénicos. Se diseñaron 2 guías con el programa online BreakingCas, sobre la secuencia del gen GGTA1 que codifica el dominio catalítico de laenzima. Los guías se clonaron en los plásmidos pU6-sgRNA (Addgene #49045)y pT7-sgRNA (#51132) bajo los promotores U6 y T7, respectivamente, segúnsea para el uso de plásmidos (junto con pCMVCas9 #44758) o complejo RNP(con la proteína Cas9 NEB M0646T). Para generar el complejo, se realizó unasíntesis in vitro del ARN. La actividad del complejo fue testeada in vitro. Para unarápida y económica detección de la interrupción del gen, utilizamos la técnica dedropout knock-out, donde se utilizan dos guías para inducir la deleción delsegmento interno. Aunque con este sistema se subestima la tasa de edición delos guías, ya que no se registran cortes individuales o asincrónicos, se puededetectar la deleción en un gel de agarosa por una diferencia de movilidad deamplicones. La herramienta CRISPR-Cas9 fue microinyectada en oocitosactivados partenogenéticamente, que se cultivaron in vitro durante 7 días a 38ºCy una atmósfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% N2. Los blastocistos fuerontratados con proteinasa K y SDS, y sometidos a dos PCR anidadas. Losproductos fueron resueltos en geles de agarosa al 2%. El amplicón sin deleciónda un fragmento de 794 pb, y con deleción de 326 pb. Se observó una diferenciasignificativa (p=0,005; p