INVESTIGADORES
KEUNCHKARIAN Sonia
congresos y reuniones científicas
Título:
Método de cuantificación intracelular de 2-hidroxietidio mediante cromatografía líquida en gradiente
Autor/es:
LEBED, P.J,; OSORIO, J,; GIAMBELLUCA, M.S,; GOTTA, J.; KEUNCHKARIAN, S.; CASTELLS, C.B.
Lugar:
Bahía Blanca, Argentina
Reunión:
Congreso; V Congreso Argentino de Química Analítica; 2009
Institución organizadora:
Comité Organizador
Resumen:
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Las especies reactivas de oxígeno son generadas fisiológicamente en
pequeñas cantidades durante la fosforilación oxidativa y además son generadas
por los leucocitos polimorfonucleares durante el estallido oxidativo. Dado que
estas especies tienen vida media muy corta, el análisis directo es complejo por
lo cual se utilizan técnicas indirectas para detectar estos radicales in
vitro e in vivo. Dentro de ellas, las sondas fluorescentes son
herramientas ampliamente utilizadas para detectar especies reactivas de oxígeno
dado que proveen una buena resolución espacio-temporal así como un amplio rango
dinámico además de ser fáciles de utilizar y de bajo costo.
La hidroetidina (HE) ha sido utilizada como sonda para detectar
específicamente la producción de radical superóxido intracelular mediante
microscopía de fluorescencia y citometría de flujo en diferentes tipos de
células y tejidos. Recientemente, se ha descubierto que el producto de reacción
entre hidroetidina y el radical superóxido es el 2-hidroxietidio (2-OH-E+) y no etidio (E+) como
se pensaba previamente, y que este ión no podría obtenerse por la acción de
otros oxidantes intracelulares.
Este ión específico tiene una estructura química que difiere del etidio
en un átomo de oxígeno, por lo cual ambos iones tienen un espectro de
fluorescencia similar lo que implica una seria limitación al momento de
interpretar correctamente datos cualitativos y cuantitativos basados en
técnicas fluorescentes. Por esta razón, se han sugerido métodos con un paso de
separación previo por cromatografía líquida o técnicas de electromigración. Los
métodos por HPLC incluyen condiciones de elución de fase reversa asociados a
detectores de fluorescencia o electroquímicos. Sin embargo, los métodos
propuestos en la literatura exhiben una baja resolución entre los dos picos
fluorescentes, lo cual no sería suficiente para la detección de niveles traza
de 2-OH-E+, y todos ellos exhiben tiempos de análisis en el rango de 20-30
minutos, lo cual no es adecuado para análisis de rutina.
En este estudio, reportamos la optimización de la resolución
2-OH-E+/E+ con una tiempo de análisis corto utilizando columnas de C18 o fenilo
y condiciones de elución en gradiente. Se determino la repetibilidad, rango
lineal y límites de detección y cuantificación de 2-OH-E+. Se discute la
aplicación del método optimizado a la medición de 2-OH-E+ intracelular en
neutrófilos humanos de individuos sanos.
