¿Es la pegilación la solución al uso del anticuerpo recombinante FABC11:Stx2 para neutralizar la toxina Shiga in vivo?

MACEDO HENRIQUE IZABELLA; SACERDOTI FLAVIA; AMARAL MARÍA MARTA; PALERMO MARINA; IBARRA CRISTINA; LUZ DANIELA; PIAZZA ROXANE MP

Buenos Aires

Simposio; 1er Simposio Argentino sobre Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC/VTEC) responsable del Síndrome Urémico Hemolítico.; 2022

UBA-INTA-Asociación LUSUH

Los anticuerpos se utilizan como herramientas terapéuticas en laclínica desde hace varias décadas. Actualmente, no existe un consenso sobre eltratamiento para la intoxicación por toxina Shiga (Stx) y la utilización deanticuerpos para ello tiene una perspectiva interesante para investigar. Eneste sentido, la administración de IgG completa puede impedir la llegada deeste biofármaco a los tejidos y causar efectos adversos por la porcióncristalizable (Fc). La utilización del fragmento Fab sólo resuelve estosefectos, pero en contraparte, reduce significativamente la vida media delproducto biofarmacéutico en el cuerpo de aproximadamente 7-21 días a 0,3-1 hs.  Previamente demostramos que FabC11:Stx2,generado por la tecnología phage display neutralizó el efecto de las toxinas(Stx1 y Stx2), e inhibió hasta en un 100% la citotoxicidad en célulasepiteliales y endoteliales renales. Sin embargo, en estudios in vivo, protegióa los ratones sólo cuando se coincubó con Stx2. La hipótesis que planteamos es que aumentar lavida media del fragmento permite potenciar su acción in vivo. Para elloproponemos mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de lamolécula a través de la pegilación, que confiere, además, una mejora en lahidrodinámica, un aumento en la estabilidad y una disminución en lainmunogenicidad. En el presente estudio, se seleccionó el diseño de pegilaciónpor lisinas y cisteínas disponibles para la unión Fab-PEG. El análisis insilico de Fab por el software Pymol, mostró la presencia de una sola cisteínalibre para la conjugación. La reacción específica del sitio se realizó con PEGmaleimida de 20 y 40 kDa en proporción 1:15 (Fab:PEG) y se redujo con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en proporción 1:20 (Fab:TCEP) y se purificóFabC11:Stx2-PEG por cromatografía de exclusión molecular. Dado que la conjugación proporciona una disminuciónen el rendimiento final del bioproducto y ya que este fragmento de anticuerporecombinante se produce en E. coliBL21, en el presente trabajo propusimos optimizar el cultivo bacteriano paramejorar su obtención. Para ello, se cultivaron las bacterias variando lossiguientes parámetros: composición nutricional [(medios de cultivo 2YT, caldolisogénico (LB) y caldo Terrific (TB)], fuentes de carbono (glucosa y glicerol)y temperatura post-inducción (25°C y 37°C). Se observó una mayor tendencia a lamultiplicación celular en el medio TB y a 25°C en relación al 2YT y que el usode fuentes mixtas de carbono (glicerol y glucosa) es similar a las pruebas queusan solo glucosa a 25°C. Por SDS /PAGE se observó un componente de masamolecular relativa de 150 kDa referente al FabC11:Stx2-PEG y la reactividad deesta molécula contra Stx2 fue similar al Fab nativo evaluado por ELISA. En estetrabajo se seleccionó el diseño de pegilación específico del sitio, seoptimizaron los parámetros de crecimiento bacteriano y los resultadospreliminares de los análisis in vitro mostraron buena reactividad deFabC11:Stx2-PEG contra Stx. Proponemos que FabC11:Stx2-PEG puede ser una buenaherramienta y un futuro tratamiento para la neutralización de la toxina Shiga in vivo.@font-face{font-family:"Cambria Math";panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4;mso-font-charset:0;mso-generic-font-family:roman;mso-font-pitch:variable;mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face{font-family:Calibri;panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4;mso-font-charset:0;mso-generic-font-family:swiss;mso-font-pitch:variable;mso-font-signature:-1610611985 1073750139 0 0 159 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal{mso-style-unhide:no;mso-style-qformat:yes;mso-style-parent:"";margin:0cm;margin-bottom:.0001pt;mso-pagination:widow-orphan;font-size:12.0pt;font-family:"Calibri",sans-serif;mso-fareast-font-family:Calibri;mso-bidi-font-family:Calibri;mso-fareast-language:ES-AR;}.MsoChpDefault{mso-style-type:export-only;mso-default-props:yes;font-family:"Calibri",sans-serif;mso-ascii-font-family:Calibri;mso-fareast-font-family:Calibri;mso-hansi-font-family:Calibri;mso-bidi-font-family:Calibri;mso-fareast-language:ES-AR;}div.WordSection1{page:WordSection1;}