DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA POR PCR REAL-TIME PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LA MUTACIÓN T315I

BIANCHINI M; LARRIPA I

Mar del Plata

Congreso; SAH; 2009

La translocación cromosómica [t(9;22)(q34;q11)] y la consecuente formación del gen de fusión BCR-ABL, genera una tirosina quinasa (TK) permanentemente activada responsable de la etiopatogenia de la leucemia mieloide crónica (LMC). El Imatinib es un inhibidor selectivo de esta TK y por lo tanto es utilizado como tratamiento de primera línea en esta patología. Sin embargo la presencia de mutaciones puntuales en el dominio TK genera isoformas de la proteína que son resistentes a la acción del Imatinib. Más de 40 mutaciones han sido reportadas, de las cuales solamente algunas son clínicamente relevantes; una de las más importantes es la T315I cuya presencia genera un clon neoplásico altamente resistente a cualquier tipo de inhibidor de TK. Por este motivo la detección precoz es muy importante para definir la conducta terapéutica. El objetivo de este trabajo fue poner a punto una metodología muy específica de alta sensibilidad y selectividad que permita detectar y cuantificar la mutación T315I mediante Real Time PCR. Para ello se clonaron en el plásmido (pCR®2.1-TOPO®, Invitrogen) las secuencias génicas BCR-ABL mutada y no mutada (WT), provenientes de productos de PCR obtenidos con primers específicos a partir de RNA de pacientes con y sin la mutación respectivamente. Una vez obtenidos los constructos WT y mutado, estos fueron utilizados en diluciones crecientes para obtener las curvas de calibración; a tal propósito utilizamos la química de detección Taqman combinada con primers específicos (ARMS) que permiten reconocer el alelo mutado. La metodología desarrollada demostró una alta sensibilidad y selectividad pudiendo detectar hasta una copia del alelo mutado en 1000 no mutados (0,1%). Esta metodología contrasta con los métodos actuales de secuenciación que poseen una selectividad del 10%. Este abordaje nos permitirá monitorear la presencia de la mutación T315I en pacientes LMC y al mismo tiempo cuantificar rápidamente la abundancia del clon BCR-ABL mutado con respecto al mismo clon no mutado.