Analisis metodologico comparativo por microdisección laser de tumores solidos

BIANCHINI M, LEVY EM, BRAVO AI, FURMAN D, VON EUW EM, DOMENECHINI E, PINSKY V, BARRIO MM, MORDOH J

Mar del Plata (Argentina)

Congreso; SOC.ARG. DE INV. CLINICA; 2006

El desarrollo y la aplicación de las técnicas de microdisección laser (MDL) de tejidos ha generado un importante avance con respecto a los análisis moleculares de tumores sólidos y su microambiente. En el presente trabajo hemos establecido un protocolo para la conservación, y fijación de muestras de tumores sólidos para su posterior procesamiento por MDL. Comparando diferentes alternativas de conservación y almacenamiento (con o sin agregado de conservantes químicos) microdisecamos muestras de carcinoma de colon, mama y melanoma utilizando un microscopio Leica AS LMD. Luego de establecer parámetros clave de la MDL (calibración del láser, definición y medición de áreas de corte) se colectaron las micromuestras conteniendo células tumorales, estroma, infiltrado linfocitario y/o tejido normal en el buffer de lisis celular específico. El RNA y las proteínas extraídas fueron cuantificadas obteniéndose valores promedio de 400 ng de RNA en cortes de aproximadamente 600 células tumorales y 1 mg de proteínas en cortes de aproximadamente 2500 células tumorales. El análisis posterior por RT-PCR y western blot, permitió evaluar genes y proteínas de diferentes tamaños y abundancia. Se logró establecer que el número mínimo de células requerido para la amplificación de un gen es de 100 a 1000 células; en el caso de las proteínas es necesario procesar un número mayor de células (de 1000 a 10000). Se obtuvieron resultados positivos en la amplificación de los genes constitutivos b2-microglobulina y GAPDH probados en los tejidos mencionados. En el caso de genes menos abundantes y de expresión mas restringida como PAK6, FKBP6 y CSPG3 su detección fue dependiente de la celularidad, del tipo celular y tamaño del amplicón. Como conclusión, este trabajo nos permitió establecer una metodología para acceder al estudio in vivo de los componentes individuales de tejidos tumorales heterogéneos. Esta herramienta permitirá caracterizar nuevos biomarcadores tumorales y evaluar la progresión tumoral.