¿Es la pegilación la solución al uso del anticuerpo recombinante FabC11:Stx2 para neutralizar la toxina Shiga in vivo?

HENRIQUE, IZABELLA DE MACEDO; SACERDOTI, FLAVIA; AMARAL, MARÍA M.; PALERMO, MARINA; IBARRA, CRISTINA; LUZ, DANIELA; PIAZZA FONTES, ROXANE MARIA

Buenos Aires

Simposio; Primer Simposio Argentino sobre Escherichia coli productor de toxina Shiga responsable del Síndrome Urémico Hemolítico. VTEC Argentina 20-22 de Abril de 2022; 2022

Los anticuerpos se utilizan como herramientas terapéuticas en la clínica desde hace varias décadas. Actualmente, no existeun consenso sobre el tratamiento para la intoxicación por toxina Shiga (Stx) y la utilización de anticuerpos para ello tiene unaperspectiva interesante para investigar. En este sentido, la administración de IgG completa puede impedir la llegada de estebiofármaco a los tejidos y causar efectos adversos por la porción cristalizable (Fc). La utilización del fragmento Fab sólo resuelveestos efectos, pero en contraparte, reduce significativamente la vida media del producto biofarmacéutico en el cuerpo deaproximadamente 7-21 días a 0,3-1 hs. Previamente demostramos que FabC11:Stx2, generado por la tecnología phage displayneutralizó el efecto de las toxinas (Stx1 y Stx2), e inhibió hasta en un 100% la citotoxicidad en células epiteliales y endotelialesrenales. Sin embargo, en estudios in vivo, protegió a los ratones sólo cuando se coincubó con Stx2. La hipótesis que planteamoses que aumentar la vida media del fragmento permite potenciar su acción in vivo. Para ello proponemos mejorar las propiedadesfarmacocinéticas y farmacodinámicas de la molécula a través de la pegilación, que confiere, además, una mejora en lahidrodinámica, un aumento en la estabilidad y una disminución en la inmunogenicidad. En el presente estudio, se seleccionó eldiseño de pegilación por lisinas y cisteínas disponibles para la unión Fab-PEG. El análisis in silico de Fab por el software Pymol,mostró la presencia de una sola cisteína libre para la conjugación. La reacción específica del sitio se realizó con PEG maleimidade 20 y 40 kDa en proporción 1:15 (Fab:PEG) y se redujo con tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP) en proporción 1:20 (Fab:TCEP) yse purificó FabC11:Stx2-PEG por cromatografía de exclusión molecular. Dado que la conjugación proporciona una disminuciónen el rendimiento final del bioproducto y ya que este fragmento de anticuerpo recombinante se produce en E. coli BL21, en elpresente trabajo propusimos optimizar el cultivo bacteriano para mejorar su obtención. Para ello, se cultivaron las bacterias variando los siguientes parámetros: composición nutricional [(medios de cultivo 2YT, caldo lisogénico (LB) y caldo Terrific (TB)], fuentes de carbono (glucosa y glicerol) y temperatura post-inducción (25°C y 37°C). Se observó una mayor tendencia a la multiplicación celular en el medio TB y a 25°C en relación al 2YT y que el uso de fuentes mixtas de carbono (glicerol y glucosa) es similar a las pruebas que usan solo glucosa a 25°C. Por SDS /PAGE se observó un componente de masa molecular relativa de 150 kDa referente al FabC11:Stx2-PEG y la reactividad de esta molécula contra Stx2 fue similar al Fab nativo evaluado por ELISA. En este trabajo se seleccionó el diseño de pegilación específico del sitio, se optimizaron los parámetros de crecimiento bacteriano y los resultados preliminares de los análisis in vitro mostraron buena reactividad de FabC11:Stx2-PEG contra Stx. Proponemos que FabC11:Stx2-PEG puede ser una buena herramienta y un futuro tratamiento para la neutralización de la toxina Shiga in vivo.