Estudio del desplegado de la TRX de E. coli: rol de la hélice α C-terminal en la estabilización del estado de transición y del estado nativo

DIEGO SEBASTIAN VAZQUEZ; LUCIA B. CHEMES; IGNACIO E. SANCHEZ; MAURICIO P. SICA; JAVIER SANTOS

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Congreso; XL Congreso Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Fundación Instituto Leloir

La tiorredoxina de Escherichia coli (TRX) es una proteína pequeña, compuesta por 108 residuos (12 kDa) que presenta un plegado compuesto por 5 hebras beta rodeadas por 5 hélices alfa. Es altamente soluble, fácilmente purificable y termodinámicamente estable en un amplio rango de temperatura (GH20=8 kcal/mol a 25 C). Estas características la convierten en un excelente modelo para estudios biofísicos de plegado. Estudios de complementación entre el modulo TRX1-93 y el péptido sintético TRX94-108 silvestre o conteniendo mutaciones de L por A en las posiciones 94, 99, 103 y 107 (Santos, 2007 y 2009) demostraron que la hélice C-terminal (HCT) aporta interacciones claves en la estabilización del complejo, y que su presencia es requerida para la adquisición de estructura terciaria nativa. Ciertamente la HCT juega un papel importante en la adquisición de la conformación nativa, pero ¿Cuál es el rol de la HCT en la ruta de plegamiento de la TRX. Estudios recientes de nuestro grupo de utilizando simulaciónes de dinámica molecular (MDS) indicaron la presencia de un intermediario con un alto número de contactos nativos en el cual la HCT pierde su estructura helicoidal, y un estado de transición de plegado (TS) con estructura preponderantemente β. En forma coincidente, la presencia de intermediarios de replegado con estructura β pudo ser inferida a partir de experimentos de cinética rápida (Georgescu RE, 1998). Nuestra hipótesis es que la adquisición de la HCT es un evento tardío en el proceso de plegado de la TRX. Para investigarlo diseñamos una serie de mutantes puntuales de longitud completa, todas ellas ubicadas en la HCT de la TRX: L94A, L99A, E101G, F102A, L103A, N106A y L107A. Mediante la medición de relaciones entre las energías libres cinéticas y de equilibrio de las diferentes mutantes de la HCT y de la proteína silvestre, conocido como análisis de valores  (Fersht, 1992), nos proponemos determinar si la HCT se encuentra o no estructurada en el estado de transición de plegado.