Diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 en mascotas

MORÉ, G.

Otro; XXIII Reunión Científico Técnica de la AAVLD; 2021

Los coronavirus son virus de ARN envuelto que infectan aves y mamíferos. La mayoría están adaptados a una especie hospedadora, sin embargo, su alta frecuencia de mutación determina una alta diversidad genética y la eventual adaptación a otros hospedadores. Este ?salto? de especies, y en particular desde animales a humanos, ha sido la teoría de génesis del SARS-CoV-2 y de la actual pandemia de la enfermedad producto de su infección, conocida como Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). La detección de SARS-CoV-2 en animales es uno de los eslabones epidemiológicos que requieren atención y ha sido recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Los animales podrían actuar como un hospedador natural, intermediario y/o reservorio para la infección en humanos. Actualmente, se está llevando a cabo el diagnóstico y monitoreo de la infección con SARS-CoV-2 en muestras de animales de todo el mundo, reportándose casos en felinos, caninos, hurones y visones. Genera preocupación la introducción y circulación de nuevas cepas de virus en el hombre, que resulten en modificaciones de transmisibilidad o virulencia y en una disminución de la eficacia de los tratamientos y de las vacunas. Desde mediados del 2020 llevamos adelante parte del proyecto financiado por la Agencia Nacional de promoción a la Investigación, Desarrollo Tecnológico e Innovación en asociación titulado Detección y caracterización molecular del SARS-CoV-2 en animales y vigilancia epidemiológica de posibles reservorios, amplificadores y/o transmisores del virus. Los objetivos del proyecto involucran el diagnóstico y la vigilancia epidemiológica de animales pertenecientes a personas infectadas con SARS-CoV-2.Los métodos de diagnóstico para SARS-CoV-2 disponibles actualmente, se basan principalmente en la detección de fragmentos génicos mediante real time RT-PCR y han sido validados utilizando diversos patógenos respiratorios humanos. En nuestro país existen numerosos kits comerciales disponibles y aprobados por la ANMAT para su uso en diagnóstico, bajo situación excepcional, de la infección en humanos. Nuestro grupo de trabajo integra el laboratorio que la Facultad de Ciencias Veterinarias-UNLP puso a disposición para el diagnóstico por real time RT-PCR de hisopados derivados por el Ministerio de Salud de la Provincia de Buenos Aires mediante un convenio específico. Como parte de este convenio se procesaron más de 6000 muestras mediante kits de real time RT-PCR del tipo ?one-step? en multiplex con sondas tipo TaqMan provistos por el Ministerio. Los kits utilizados fueron los siguientes: 1- BGI= Real-Time Fluorescent RT-PCR Kit for Detecting SARS-CoV-2 (BGI, China) con 1 target viral y B-actina como target de control interno; 2-GF= GeneFinder? COVID-19 Plus RealAmp kit (OSANG Healthcare, Korea), con 3 fragmentos o targets virales y 3- AP= DisCoVery SARS-CoV-2 RT-PCR detection kit Cy5 (AP-Biotech, Argentina) de 2 targets virales. Los kits 2 y 3 utilizan como control interno un fragmento de la RNApol humana. Luego de análisis comparativos sobre muestras de hisopados humanos, se seleccionó para uso en animales el kit AP como el de mejor sensibilidad y especificidad. En base a la experiencia en el uso de éstos kits y gracias al financiamiento de Agencia, se decidió realizar el diagnóstico en muestras animales adquiriendo y adaptando estos kits comerciales. Teniendo en cuenta el costo de estos kits, se propuso restringir el testeo a mascotas de personas con diagnóstico positivo para SARS-CoV-2.Se tomaron muestras, de hisopados orofaringeos y rectales de 46 caninos y 35 felinos con la utilización de equipamiento de protección personal apropiado. Las muestras fueron transportadas refrigeradas y en triple envasado al laboratorio. Se adaptó la extracción de ARN con kits comerciales, para incorporar ARN humano en el proceso de purificación, bajo cabina de seguridad biológica tipo II. De éste modo, es posible utilizar el control interno (RNApol humana) de los kits de PCR como monitor de la extracción y potencial presencia de inhibidores. Se detectó reacción a los targets virales en muestras de hisopado orofaríngeo y rectal de un felino y un canino y sólo en el orofaríngeo de otro felino y otro canino. Los valores de Ct en las muestras fueron considerados ?altos? indicando a priori, bajas cargas virales. En el canino y felino que resultaron positivos en ambos hisopados los Ct en la muestra de hisopado rectal fueron mayores y cercanos a los valores de corte del kit, indicando una menor cantidad de genoma viral en esas muestras. Los animales reactivos no presentaron signología importante, y solo una de los felinos presentó estornudos. Los animales fueron nuevamente muestreados alrededor de una semana después del diagnóstico inicial y en todos los casos el resultado de la real time RT-PCR fue no reactivo o no detectable para los targets virales. Los hallazgos fueron reportados ante la OIE. El hisopado orofaríngeo de esta gata con estornudos presentó los Ct para targets virales más bajos (Ct alrededor de 30). Sobre ésta muestra se procedió a la secuenciación de fragmentos y del genoma completo para confirmar la identidad y variante de SARS-CoV-2 detectada. Se confirmó la identidad y se detectó la variante o linaje B.1.499, la cual era frecuentemente detectada en casos humanos del Área Metropolitana de Buenos Aires al momento de detección en el felino. Estos resultados fueron recientemente publicados (Fuentealba et al., 2021). Nuestros resultados sugieren, en principio, una infección de las mascotas a través del contacto estrecho con sus responsables humanos infectados. Es recomendable que las personas consideradas como caso sospechoso o confirmado, traten de evitar el contacto estrecho con sus mascotas de modo de evitar las infecciones animales y minimizar los riesgos de ?saltos? de especies y potenciales recombinaciones.Sin embargo, es necesaria la estandarización de métodos directos e indirectos que permitan la detección específica de SARS-CoV-2 en diferentes muestras provenientes de animales susceptibles como los caninos, felinos y visones, y que sean más accesibles económicamente para estudios poblacionales. La correcta identificación de las diversas infecciones por coronavirus específicos de especie, y la diferenciación de la infección por SARS-CoV-2 en animales, permitirá la estandarización de los test diagnósticos disponibles actualmente para SARS-CoV-2, el diseño de nuevos test a nivel local y su posterior uso en la vigilancia epidemiológica de los animales.