Métodos empleados en la purificación de enzimas

BOTTERO D; HOZBOR D

Catálisis enzimática Fundamentos químicos de la vida

EDULP

Año: 2016; p. 179 - 199

Los organismos estan compuestos por una amplia variedad de proteínas que aunquedifieren en la secuencia de sus aminoácidos, y en el plegamiento 3-D de la cadena deaminoácidos, comparten una serie de propiedades ya que se componen esencialmente de losmismos aminácidos. Es así que varias proteínas que se encuentran en un mismo organismopueden compartir algunas propiedades como por ejemplo su tamaño o su carga. Enconsecuencia cuando se busca purificar alguna proteína se deben realizar una serie de pasossecuenciales (marcha de purificación) en los que se van discriminando diferencias que enmuchos casos resultan ser sutilies. El diseño de una estrategia purificación de proteínas esalgo así como la búsqueda de una ruta que debe transitarse en tramos eliminando loinnecesario hasta alcanzar el objetivo con solo lo necesario. Diferentes rutas y diferentestramos de rutas pueden ser exploradas y para continuar, cada tramo andado debe seranalizado adecuadamente de forma de tomar decisiones sobre si retroceder o seguir y en casode seguir se debe analizar cuál sería el mejor tramo para continuar el camino. La elección detramos se debe realizar en base a consideraciones sobre cómo evitar pérdidas de lo necesario,favorecer al máximo la eliminación de lo innecesario y también los costos y tiempo. Así en cadopaso de purificación se debe evaluar no solo el rendimiento en la purificación de la proteínaproblema sino también la pureza alcanzada de la misma. Si bien no hay una sola secuencia detécnicas a seguir, en general se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguircon las de baja capacidad pero mayor especificidad. La estrategia a emplear deberá diseñarseteniendo en cuenta la cantidad y el grado de pureza que se quiera alcanzar según el uso quese dará a la proteína. Para usos en investigación, la escala es en general reducida y es masimportante la pureza que el rendimiento. Para usos terapéuticos la escala es mayor y la purezarequerida es máxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajocosto y menor pureza. Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de donde sela extraerá, conviene buscar una fuente fácil de obtener, que contenga esa proteína enabundancia y de ser posible de bajo costo. Lo óptimo sería producir la proteína por métodos deADN recombinante. Dependiendo también de la finalidad, la proteína que se quiere purificardeberá ser obtenida en conformaciones nativas o desnaturalizadas. Por ejemplo para evaluaractividad biológica la proteína debe tener una estructura funcional, en cambio para determinarla estructura primaria, la proteína puede estar desnaturalizada.En este capítulo se presenta una descripción que incluye los aspectos más sobresalientesde las técnicas más utilizadas en el aislamiento, purificación y caracterización de enzimas.Antes de introducirnos en las técnicas es importante tener en cuenta que es imposiblediseñar y o realizar una estrategia de purificación de una proteína si no contamos con unmétodo cuali y cuantitativo específico de la proteína en cuestión. Debemos contar conmetodologías que nos permitan analizar luego de cada etapa de purificación si la proteínaproblema está, cómo está y de estar determinar en qué cantidad está. En el caso de enzimas,mientras que la determinación de las unidades enzimáticas totales (Actividad enzimática)resulta esencial para evaluar el rendimiento de su purificación, las medidas de la actividadespecífica (AE, relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad deproteína total nos indica el grado de purificación alcanzado. El redimiento y el grado depurificación pueden evaluarse en forma global comparando los valores de actividad total yactividad específica hallados en la etapa final de la marcha de purificación respecto de losobtenidos en la etapa inicial de la purificación pero también puede evaluarse en cada nuevaetapa respecto de la etapa anterior. En el primer caso estariamos evaluando el proceso globalde la marcha de purificación y en el segundo estas determinaciones nos hablarán de laeficiencia de una etapa de purificación en particular.