Del ADN al cristal: enzimas de resistencia antibiótica en el confín del mundo

Por Pablo Power*

La continua e incansable batalla contra las infecciones bacterianas producidas por microorganismos resistentes a los antibióticos parece estar siendo ganada por las bacterias por puntos, con riesgo de terminar perdiéndola por K.O. técnico si no adoptamos medidas eficaces en los próximos años.

Existen diversos patógenos que expresan mecanismos de resistencia en constante evolución y adaptación para contrarrestar y evadir la acción de los agentes antimicrobianos, a pesar de que formulaciones supuestamente mejoradas o incluso nuevas drogas, son utilizadas en la práctica médica. Esta situación hace que años de investigación y desarrollo de nuevos antibióticos corran el riesgo de derrumbarse como castillo de naipes en poco tiempo.

Entre los mecanismos de resistencia existentes, la producción de β-lactamasas es el más frecuente entre bacterias patógenas. Estas enzimas hidrolizan las moléculas de antibióticos β-lactámicos (el grupo más utilizado para el tratamiento de infecciones bacterianas), volviéndolos inútiles para ejercer su acción terapéutica. En general, se las puede dividir en dos grandes grupos funcionales: (i) las “serino-β-lactamasas” (clases A, C y D) que funcionan gracias a la presencia de un residuo de serina esencial para la interacción con la molécula del β-lactámico, y que pertenecen a la misma familia que otras serino-proteasas como las “penicillin binding proteins” (PBP) bacterianas encargadas de la síntesis de la pared celular de peptidoglicano, y que son los blancos moleculares de los β-lactámicos; y (ii) las “metalo-β-lactamasas” (MBLs), que contienen uno o dos átomos de zinc en el sitio catalítico, algunas poseen un espectro de acción que abarca casi todos los β-lactámicos disponibles, y forman parte de una super-familia de proteínas con funciones muy diversas.

Desde su descubrimiento, las β-lactamasas evolucionaron continuamente, principalmente a través de la acumulación y selección de mutaciones que fueron expandiendo o modificando el espectro de antibióticos capaces de ser hidrolizados, proceso que fue acelerado y favorecido por el (ab)uso persistente de antibióticos.

Durante la última década ha quedado ampliamente documentado que al menos algunas de las β-lactamasas más frecuentes descriptas entre patógenos clínicos provienen de microorganismos de origen ambiental, en donde la presencia de actividad antrópica, y por lo tanto del uso de antibióticos, es prácticamente nula o al menos escasa. Desde allí, los genes que codifican para estas enzimas han logrado ganar acceso a plataformas génicas que les sirvieron de medio de diseminación entre diferentes bacterias por mecanismos de transferencia horizontal de genes (THG).

Sin embargo, sólo podemos estudiar aquellos microorganismos ambientales que, al igual que los patógenos asociados a infecciones clínicas, son capaces de desarrollar en medios de cultivo de laboratorio. Aunque nos cueste imaginarlo, se considera que no mucho más del 1 por ciento de las especies microbianas que habitan nuestro planeta son capaces de desarrollarse en medios de cultivo convencionales, por lo cual la “mayoría no cultivable”, que representa el otro 99 por ciento, es necesario abordarla mediante estrategias que eviten la necesidad de utilizar técnicas de cultivo.

A fines de los ’90, el grupo liderado por la investigadora estadounidense Jo Handelsman desarrolló una ingeniosa estrategia: extraer directamente el ADN metagenómico proveniente de una comunidad microbiana presente en una muestra representativa de suelo, agua, sedimento, o incluso material biológico como hueso, placa dentaria, etc, y a partir de ese material, identificar y analizar nuevos genes y proteínas sin utilizar técnicas basadas en cultivo. De este modo, fue posible detectar nuevos genes asociados a resistencia antimicrobiana en diversas muestras de suelo, incluyendo nuevas β-lactamasas muy distantes filogenéticamente a las encontradas en aislamientos clínicos resistentes. Estas enzimas fueron detectadas por el grupo de Handelsman en muestras de suelo de Alaska, por lo cual recibieron el nombre de LRA, por “β-Lactam Resistance from Alaskan soil”.

Desde hace unos años, nos dedicamos al estudio bioquímico y estructural de estas β-lactamasas metagenómicas, para evaluar las posibles similitudes o diferencias con las enzimas conocidas, y de esa manera poder predecir cuáles podrían ser los posibles caminos evolutivos de las β-lactamasas más asociadas con patógenos nosocomiales, y aportar evidencias estructurales para el diseño de mejores drogas inhibitorias de estas enzimas. Así, como parte de un trabajo colaborativo entre nuestro grupo de trabajo en el Laboratorio de Resistencia Bacteriana de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (UBA), y el Laboratorio de Cristalografía del Centro de Ingeniería de Proteínas de la Universidad de Lieja, Bélgica (liderado por Paulette Charlier), hemos obtenido la estructura cristalográfica de la metalo-β-lactamasa de origen metagenómico denominada LRA-12, perteneciente a la sub-clase B3 de MBLs, con un 60 por ciento de identidad aminoacídica con las β-lactamasas GOB, y sólo 40 por ciento con FEZ-1, la MBL más cercana en similitud de secuencia para la cual existe la estructura cristalográfica.

Hemos logrado determinar la estructura de la β-lactamasa con una resolución de 2,1 Å. En ella, pudimos observar la presencia de aminoácidos específicos (cuatro histidinas, un ácido aspártico y una glutamina) que mantienen la integridad y funcionalidad de la cavidad catalítica, lugar donde se unen y destruyen los β-lactámicos. Estos aminoácidos se agrupan funcionalmente en dos sitios (glutamina más dos histidinas en el sitio 1, y aspártico más las otras dos histidinas en el sitio 2), unidos a 2 átomos de zinc, esenciales para la hidrólisis del antibiótico.

Esta arquitectura del sitio catalítico es compatible con las metalo-β-lactamasas de la familia GOB, descriptas en microorganismos ambientales, pero diferente a las comúnmente aisladas de patógenos clínicos, como las familias NDM, VIM e IMP. Además, contiene dominios estructurales aparentemente más flexibles en comparación con otras enzimas, lo cual podría estar asociado a la elevada actividad hidrolítica observada sobre la mayoría de los β-lactámicos, incluyendo los carbapenemes, que representan la última alternativa frente a muchos microorganismos altamente resistentes.

Este estudio aporta nuevas evidencias que confirman la importancia del ambiente como reservorio natural de mecanismos de resistencia a antibióticos, que existen y se perpetúan aún en ausencia de presión de selección antibiótica. ¿Cuál es la función de estas enzimas en el ambiente? es una incógnita aún. Pero el estudio de estas β-lactamasas metagenómicas podría brindarnos una nueva percepción acerca de la evolución génica, bioquímica y estructural de las β-lactamasas.
Quedará planteada la pregunta: ¿serán estas enzimas capaces de aparecer en patógenos humanos? No tenemos la respuesta aún, pero los ingredientes necesarios parecen estar ahí afuera aguardando.