“Caracterización de dos fracciones purificadas de macrodontina”

C. L. NATALUCCI, C. SEQUEIROS, L.M.I. LÓPEZ, S. TREJO, C. LLERENA SUSTER Y NÉSTOR O. CAFFINI

Mendoza, Argentina.

Congreso; XXXIV Reunión Anual de SAIB; 1998

SAIB

A partir de frutos semimaduros de Pseudoananas macrodontes (Morr.) Harms se han aislado y purificado en nuestro laboratorio fitoproteasas con un alto grado de homología en relación a bromelina, proteasa obtenida del ananá.  El extracto crudo obtenido por trituración de los frutos en buffer fosfatos 0,1 M de pH 6, con el agregado de EDTA 5 mM y cisterna 5 mM fue purificado por cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-Sepharose FF, buffer Tris-HCl de pH 8,1, eluyendo con un gradiente de cloruro de sodio 0,05 a 0,1 M), permitiendo la separación de dos fracciones proteolíticamente activas (I y II). La electroforesis bidimensional (nativa-desnaturalizante) demostró la homogeneidad de las fracciones separadas, estando ambas constituídas por una única cadena polipeptídica (Fracción I: 27,8 kDa, Fracción II: 29,5 kDa). El perfil de pH frente a caseína de la fracción I está ligeramente desplazado hacia valores inferiores de pH en relación al obtenido con el extracto crudo. La actividad de esta fracción frente a sustratos sintéticos del tipo N-carbobenzoxi-p-nitrofenilésteres de L-aminoácidos permitió la determinación de la actividad endoesterásica relativa respecto al aminoácido que aporta el grupo carboxilo. La reacción fue llevada a cabo a 37 ºC, registrando durante 3 minutos los cambios en la absorbancia a 405 nm, máximo del espectro de absorción del 4-nitrofenolato liberado por la enzima. Las máximas velocidades de degradación se registraron con los derivados de L-alanina, L-glutamina y L-tirosina.