Actividad biológica de aislados de fitoproteasas de bromeliáceas nativas y cultivadas en Corrientes sobre microorganismos fitopatógenos

GÓMEZ HERRERA, MELANIE DESIRÉE; AVANZA, MARÍA VICTORIA; ALAYÓN LUACES, PAULA

Jornada; . XXVIII Reunión De Comunicaciones Científicas Y Tecnológicas de la Universidad Nacional del Nordeste, Resistencia, Argentina.; 2023

Universidad Nacional del Nordeste

-INTRODUCCIÓN:La bromelina es la proteasa más usada en aplicaciones terapéuticas en personas (Baez et al., 2007). En otros estudios, fue comprobado que la expresión transgénica del gen BAA1 de la bromelina del fruto confiere una mayor resistencia a la pudrición blanda bacteriana en la col china (Brassica rapa) (Jung et al., 2008). También se ha demostrado que al extraer la bromelina del tallo, para luego analizar su actividad antifúngica y antimicrobiana, inhibió en un 90% el crecimiento de Fusarium verticilloides y F. oxysporum (Lopez-Garcia et al., 2012) y 70-95% el crecimiento de microbiano de Bacillus subtilis y Candida albicans (Dutta et al., 2013). El uso de cisteino proteasas como componente controlador de hongos para el desarrollo de nuevos agentes antifúngicos debería ser considerado (Lopez-García et al., 2012).-OBJETIVO: Evaluar la actividad biológica de aislados proteicos de Bromelia serra y Ananas comosus sobre microorganismos fitopatógenos.-MATERIALES Y MÉTODOS:1.Muestreo de material vegetal: Los ejemplares de bromeliáceas cultivadas Ananas comosus (AC), fueron provistos por el Campo Didáctico Experimental de la Facultad de Cs. Agrarias (UNNE). Se muestrearon hojas de Bromelia serra (BS), bromeliácea nativa proveniente de montes naturales de la región.2.Preparación del extracto de tallo y hojas de AC y hojas de BS: Los tallos y hojas provenientes de bromeliáceas cultivadas se lavaron con solución de peróxido de hidrógeno al 0,1 %. Ambos fueron cortados en pequeños trozos, pesados y triturados con una procesadora eléctrica en buffer Acetato de sodio 100 mM pH 5,00 en una proporción 1 g tejido/mL buffer. La suspensión se mantuvo en agitación en un baño de hielo durante 40 min, luego se filtró usando tamiz de malla gruesa y el filtrado fue dividido en alícuotas de 1 mL y conservado a -18°C hasta su empleo. Los extractos fueron precipitados con 4 volúmenes de acetona para luego resuspenderlos en sus correspondientes buffers, los cuales fueron autoclavados para evitar contaminación proveniente de los mismos. Los pellets resuspendidos en buffers se denominaron aislados proteicos.3.Activación de bacterias fitopatógenas en medio TSA. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, Xhantomonas citri pv. citri, Clavibacter michiganensis subsp michiganensis, Ralstonia solanacearum y Pseudomonas syringae. 4. Actividad antimicrobiana por la técnica de difusión en disco en placa. Se embebieron discos de papel de filtro estériles (Whattman Nº 2 de 6 mm de diámetro) con 10 μl de los aislados proteicos de AC y BS. Los discos se dejaron secar a temperatura ambiente. Se sembraron 0,1 ml. de inóculo (108 UFC/ml) en placas de Agar Tripticasa de Soja (TSA) y se colocaron los discos de papel de filtro embebidos en los aislados proteicos. Se incubaron las placas a 28ºC durante 24 h y se midió el diámetro de la zona de inhibición (Demo et al. 2005). Se realizaron controles positivos (antibióticos: Estreptomicina) y controles negativos: buffer de los extractos (De Pooter, et al. 1995)5. Determinación de concentración inhibitoria mínima (CIM) de crecimiento bacteriano por técnica de microdilución en microplacas con resarzurina al 0,01 %. 6. Actividad antifúngica mediante microdilución: La actividad antifúngica de los aislados proteicos contra cepas de Fusarium oxysporum fue evaluada mediante técnica colorimétrica en microdilución. Este ensayo utiliza el indicador redox MTT (3-4(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) de color amarillo pálido en estado oxidado, pero que presenta un color púrpura oscuro en su forma reducida (MTT-formazán). El porcentaje de inhibición de crecimiento del micelio (PIC), que corresponde a la cantidad de MTT no convertido en MTT-formazán, se calculó de acuerdo a la ecuación: PIC= [ (AC-AT)/AC] x 100donde AC corresponde a la media (n=3) de la absorbancia para el control, mientras que AT indica la media (n=3) obtenida para la absorbancia de los tratamientos.Todos los trabajos realizados sobre microorganismos fitopatógenos fueron llevados a cabo en el IBONE (UNNE-CONICET), a través de una pasantía dirigida por la Dra. Marina Cardozo.-RESULTADOS Y DISCUSIÓN:Como puede observarse en la Figura 1, de algunos tratamientos, ninguno de los aislados proteicos de AC y BS pudo lograr un halo de inhibición. Mientras que se puede observar claramente el halo inhibitorio de la Estreptomicina (control positivo).Figura 1: Césped de Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis con discos de BS, AC de tallo y AC de hoja(izquierda). Césped de Pseudomonas syringae con control positivo (Estreptomicina indicado con la letra S) (derecha).En la Figura 2 puede observarse que en los pocillos 6A y 6B corresponden a los controles negativos, es decir aquellos que solo contenían buffer con agua estéril y resarzurina. El resto de los pocillos que contenían los aislados de BS y hoja y tallo de AC que viraron a color rosado o violeta se consideran que no inhibieron a ninguna de las cepas mencionadas. Figura 2. Detección de inhibición con resarzurina. Recuadro de color naranja muestra controles negativosEn la figura 3 se puede observar que los colores amarillos corresponden a los blancos de los aislados proteicos y al caldo papa, mientras que los colores violetas indican la presencia del hongo solo o con los aislados. Los números negativos (Tabla 1) se refieren a que en presencia de los aislados hubo un menor porcentaje de inhibición, es decir, fue propicio para el crecimiento del hongo. Probablemente los extractos proteicos pudieron servir como sustratos para los microorganismos fitopatógenos, eso explicaría el aumento de crecimiento de los hongos frente a los extractos de las bromeliáceas. En cuanto al tratamiento con la Bromelina comercial difiere con Lopez García et al. (2012) ya que en sus resultados encontraron que ésta enzima tenía un efecto funguicida con Fusarium oxysporum. TratamientosPorcentaje de Inhibición (%)Br. Comercial-59,7234814AC tallo-105,666364AC hoja-116,333078BS hoja-230,19562Tabla 1: Porcentaje de inhibición del micelio Figura 3: Actividad antifúngica mediante microdilución utilizando MTT -CONCLUSIONES:Si bien ninguno de los extractos proteicos pudo controlar biológicamente a los microorganismos examinados, es necesario continuar con la purificación de los extractos proteicos para obtener enzimas proteolíticas puras, ya que en este presente trabajo solo se realizaron ensayos con extractos proteicos de Bromelia serra y Ananas comosus. -REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:•Baez, R., Lopes, M.T., Salas, C.E., Hernandez, M. (2007). In vivo antitumoral activity of stem pineapple (Ananas comosus) bromelain. Planta Med.;73(13):1377–1383•De Pooter, H.; Aboutabl, E.; El-Shabrawy, A. 1995. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of leaf, stem and rhizome of Alpinia speciosa (J.C. Wendl.) K. Schum. Grown in Egypt. Flavour and Fragance Journal. 10: 63-67•Demo, M.S. Oliva, Ma de las M., Lopez, M.L., Zunino, M.P. Zygadlo, J.A. 2005. Antimicrobial activity of essential oils obtained from aromatic plants of Argentina. Pharmaceutical Biology. 43 N 2:129-134.•Dutta, S., & Bhattacharyya, D. (2013). Enzymatic, antimicrobial and toxicity studies of the aqueous extract of Ananas comosus (pineapple) crown leaf. Journal of ethnopharmacology, 150(2), 451-457•Jung, Y.J., Choi, C.S., Park, J.H., Kang, H.W., Choi, J.E., Nou,I.S., Lee, S.Y. and Kang, K.K. (2008) Overexpression of the pineapple fruit bromelain gene (BAA) in transgenic Chinese cabbage (Brassica rapa) results in enhanced resistance to bacterial soft rot. Electron J Biotechnol 11, 1–9.•López‐García, B., Hernández, M., & Segundo, B. S. 2012. Bromelain, a cysteine protease from pineapple (Ananas comosus) stem, is an inhibitor of fungal plant pathogens. Letters in applied microbiology, 55(1), 62-67.