Estudio in vitro del daño miotóxico provocado por la PLA2 del veneno de Crotalus durissus terrificus

RODRIGUEZ JUAN PABLO; BUSTILLO SOLEDAD; ACOSTA OFELIA; MALCHIODI EMILIO; LEIVA LAURA

Resistencia, Chaco

Otro; Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2009 - UNNE; 2009

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

El daño muscular, es uno de los hallazgos más comunes en las intoxicaciones ofídicas provocadas por el género Bothrops o Crótalus. Estudios previos de éste grupo de investigación, han demostrado que el veneno entero de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) provoca daño miotóxico sistémico in vivo y que el componente principalmente responsable de tal efecto es la fosfolipasa A2 (PLA2) del complejo crotoxina (fosfolipasa A2 - crotapotín) presente en el mismo. Sin embargo, llama la atención que no genere daño local. Es probable entonces la participación de componentes plasmáticos en el mecanismo de daño muscular ocasionado por esta enzima. Específicamente, los fosfolípidos plasmáticos podrían ser hidrolizados por la fosfolipasa ofídica, liberándose lisfosfolípidos, de comprobada acción miotóxica. Para dilucidar este comportamiento, en este trabajo se estudió el efecto miotóxico del la PLA2 aislada del veneno de C.d.t. en un modelo in vitro utilizando una línea celular de mioblastos murinos (C2C12), en presencia y en ausencia de lecitinas. Las células se mantuvieron en medio DMEM (Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), a 37 ºC, en atmósfera de 5% de CO2, según procedimiento de rutina. Los repiques se realizaron cada 2-3 días, mediante el empleo de tripsina/EDTA. Para determinar la actividad citotóxica, a las 24 h de crecimiento en monocapa, las células fueron tratadas con diferentes soluciones de PLA2 (500 – 0,75 ug/ml) en medio DMEM con y sin lecitina de soja (Sigma; 1 mg/ml). A las 3 h de exposición se evaluó el efecto citotóxico mediante la medición de la viabilidad celular por colorimetría, utilizando el colorante Cristal Violeta y lectura de absorbancia a 595 nm. Se tomó como control negativo, a células no tratadas en medio de cultivo sin suero, con y sin lecitna de soja (100% de supervivencia celular). Se realizaron curvas de toxicidad a fin de determinar la Concentración Citotóxica 50 (CC50). La enzima no mostró actividad miotóxica frente a esta línea celular, reproduciendo su comportamiento in vivo, pero la viabilidad celular se redujo drásticamente ante la presencia de lecitinas en el medio de cultivo, obteniéndose una CC50 de 1,56 ug/ml, confirmando el postulado inicialmente planteado para este trabajo. Estos resultados permiten explicar la ausencia de miotoxicidad local por parte del  veneno de Crotalus durissus terrificus (cascabel). Se concluye que la PLA2 crotálica no tendría acción directa sobre las células C2C12, sino que serían los lisofosfolípidos formados como consecuencia de la acción enzimática los responsables de la muerte celular. Este mecanismo de miotoxidad indirecta aquí propuesto es similar al que presentan fosfolipasas ofidicas de vipéridos frente los eritrocitos sanguíneos.