Citotoxicidad del veneno de Bothrops alternatus sobre línea de macrófagos murinos Raw 264.7

ECHEVERRIA, SILVINA; BUSTILLO SOLEDAD; RODRIGUEZ JUAN PABLO; ACOSTA OFELIA; LEIVA LAURA

Resistencia, Chaco

Otro; Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2009 - UNNE; 2009

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE

La alteración de la respuesta inmune innata es una de las afectaciones más frecuentes en los accidentes botrópicos, en donde dichos desequilibrios se manifiestan por efectos locales de inflamación intensa, dolor e inmovilización del miembro accidentado. La patogénesis de estas expresiones es compleja, involucra la acción sinérgica de enzimas del veneno y dichos efectos son pobremente neutralizados por el antiveneno. Dado que los macrófagos juegan un rol clave en la coordinación de los eventos inflamatorios, resulta de interés generar información sobre el mecanismo de citotoxicidad del veneno de Bothrops alternatus de Argentina (yarará grande ó yarará de la cruz). En este trabajo, se evaluó la acción del veneno entero de B. alternatus sobre la línea celular de macrófagos murinos Raw 264.7. Las célul as se mantuvieron en medio de cultivo DMEM (Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), a 37 ºC, en atmósfera de 5% de CO2, según procedimiento de rutina. Los repiques se realizaron cada 2-3 días, mediante el empleo de tripsina/EDTA. Para determinar la actividad citotóxica a las 24 h de crecimiento en monocapa, las células fueron tratadas con diferentes soluciones del veneno en medio DMEM (1.25-50 μg/ml). A las 3 h de exposición se evaluó el efecto citotóxico mediante la medición de la viabilidad celular por colorimetría, utilizando el colorante Cristal Violeta y midiendo la absorbancia a 595 nm. Se tomó como control negativo, 100% de supervivencia celular, a células no tratadas a las que se adicionó solamente medio de cultivo sin suero. Los valores fueron graficados a fin de determinar la Concentración Citotóxica 50 (CC50). Por otro lado, para evaluar el mecanismo de muerte celular, las células fueron observadas con microscopía de contraste de fases al final de la incubación en orden de evaluar daños  morfológicos y la presencia de imágenes de apoptosis, inducidas por el tratamiento. El veneno botrópico indujo una disminución de la viabilidad celular proporcional a las concentraciones ensayadas. La concentración citotóxica 50 (CC50), determinada luego de 3 h de exposición, fué de 28.53 μg/ml. La observación morfológica evidenció presencia de "burbujeo" de la membrana, cuerpos apoptóticos y condensación de cromatina. Se concluye que el veneno de B. alternatus de nuestra región, muestra actividad citotóxica sobre las células Raw 264.7. El análisis morfológico sugiere que el mecanismo de apoptosis media la destrucción de las células de ésta línea celular. Posteriores estudios bioquímicos/moleculares serán necesarios para confirmar este proceso. Por otro lado, la detección de dosis no citotóxicas del veneno sobre los macrófagos murinos permitirán realizar ensayos posteriores de evaluación de la respuesta inmune innata.