Uso de un control de amplificación interno en la detección de Escherichia coli productor de toxina shiga por PCR múltiple, en heces de origen pediátrico.

SALINAS GABRIEL; ZÁRATE MARÍA; CHIALVA C; MAXIMILIANO JURI AYUB; LUCERO ESTRADA CECILIA STELLA MARYS; ESCUDERO MARÍA ESTHER

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología. VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC). I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA); 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) causa colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH) en la población infantil de nuestro país. El empleo de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la detección de este microorganismo directamente en heces de los pacientes presenta la ventaja, sobre las técnicas de cultivo, de acortar los tiempos de diagnóstico permitiendo adoptar medidas terapéuticas y epidemiológicas más efectivas. Por la naturaleza de la muestra, se corre el riesgo de obtener falsos resultados negativos debido a inhibición de la PCR. El uso de un control de amplificación interno (CAI) resulta útil para diferenciar entre resultados negativos verdaderos y falsos. CAI es una secuencia de ácido nucleicos adicionada a la mezcla de reacción para PCR con el objeto de ser co-amplificada en el mismo tubo por el par de cebadores dirigidos a la secuencia de ADN blanco y que se distingue de ésta por una diferencia en el tamaño molecular detectable por electroforesis. En este trabajo se propuso la detección de STEC directamente en heces pediátricas mediante el protocolo de PCR múltiple (PCRm) para los genes stx1, stx2 y rfb0157, diseñado en el Servicio Fisiopatogenia de INEI-ANLlS (Buenos Aires, Argentina) utilizando un CAI de 280 pb, correspondiente a una deleción interna de la secuencia stx2 original de 349 pb, y flanqueada por el mismo par de cebadores. Se contaminó 1 g de heces de niño sano con 10E9 y 10E7 ufc/ml de la cepa local (CL) E. coli 0157:H7 stx2+ aislada de un paciente pediátrico con SUH, en 9 ml de caldo EC. Se realizó extracción de ADN por él método de boiling y se preparó la mezcla de reacción incorporando CAI en concentración 0,143 pg/ul. El mismo protocolo fue aplicado en heces no contaminadas, y en diluciones de CL y de la cepa de referencia E. coli 0157:H7 EDL 933 stx1+/stx2+. El límite de detección de E. coli 0157:H7 fue de 1,3 x 10E4 ufc/25 ul de reacción de PCR en heces y de 13 ufc/25 ul de reacción de PCR en las cepas puras. Cuando la secuencia blanco (SB) se amplificó pero CAI no, se asumió que SB estaba presente en mayor proporción que el CAI y el resultado fue válido. Cuando SB no se amplificó pero el CAI sí, se asumió que SB no estaba presente o lo estaba en menor proporción que el CAI. Para evitar falsos negativos, se recomienda usar el CAI en concentración mínima para que en la competencia gane SB, y suficiente para ser detectado cuando SB no está presente. Cuando el CAI y SB no son amplificados, se asume que la muestra contiene inhibidores de la reacción, existe una incorrecta preparación de la mezcla de reactivos o mal funcionamiento del equipamiento, y por lo tanto el ensayo no es válido. La detección de E. coli STEC se puede realizar por PCRm, directamente en heces de pacientes pediátricos, en un tiempo no mayor a 4 h, utilizando CAI en reacción competitiva con el ADN blanco para evitar el riesgo de informar falsos resultados negativos.