ETAPAS PRELIMINARES EN LA PURIFICACIÓN DE UNA LECTINA TIPO C DEL VENENO DE Crotalus durissus terrificus

FUSCO LUCIANO S.; LEIVA, LAURA C

Corrientes

Jornada; XXII REUNIÓN DE COMUNICACIONES CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS 2016; 2016

Universidad Nacional del Nordeste

Del veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t) de especímenes de Brasil se purifico una lectina tipo C denominada convulxina (CVX), de la cual seestudio su capacidad agregante plaquetaria(AP) ?in vitro?, demostrando que se une a la glicoproteína VI (GPVI) en las plaquetas (Francischetti, Saliouet al. 1997; Jandrot-Perrus, Lagrue et al. 1997); como así también que es capaz de unirse a integrinas del tipo alfa2beta1 (Niedergang, Alcover et al.2000).En nuestro laboratorio se llevó a cabo el aislamiento, a partir del veneno de ejemplares que habitan el nordeste argentino, de una fracción proteica,mediante cromatografía de exclusión molecular, la que presentó propiedades AP y hemaglutinante (AH)(Fusco. et al., 2014). El control de pureza de lafracción obtenida no fue el adecuado para ensayos farmacológicos rigurosos, de allí que se dio paso a nuevas estrategias de purificación que permitanalcanzar la calidad deseada. En el presente trabajo se presentan las etapas preliminares en la purificación exhaustiva de una lectina tipo C del venenode C.d.terrificus, en el marco de una beca postdoctoral recientemente iniciada.Se trabajó con mezclas de venenos desecados del veneno deC.d.terrificus obtenido del Serpentario de la ciudad de Corrientes. Una muestra de veneno de 10 mg se disolvió en solución de Tris-HCl pH: 8 yposterior ultacentrifugación en tubos Amicon (50 kDa). La solución resultante se redujo a un volumen de 500µL que posteriormente se sembraron en unacolumna Q-FF (GE-Healthcare) instalada en un cromatógrafo líquido ÄKTAPrime Plus. Se diseño un programa con gradiente en el que la concentraciónde Tris-HCl 1M. Con las fracciones de elución se realizaron Electroforesis en gel de poliacrilamida (15%) en presencia de dodecyl sulfato de sodio(SDS-PAGE), teñidos con Coomassie Blue. Se determinó la actividad AP la que se midió a partir de un plasma rico en plaquetas (PRP), por métodoturbidimétrico. Para ello a 665 ul de PRP preincubados con 85 ul de la fracción seleccionada en PBS (1 mg/ml) durante 10 min. Por otro lado paracontrol positivo de agregación se utilizo ADP en distintas concentraciones. Las mezclas posteriormente se agitaron a 37°C, la que se continuó por 5min.Luego de la formación de grumos por la agregación plaquetaria, se dejo reposar 5 min y se leyó turbidez del sobrenadante a 410 nm. Como controlnegativo, se midió la turbidez provocada por PBS y se calculó el % de inhibición inducida por la enzima. En un frotis con plaquetas tratadas se realizo lacoloración clásica para hemograma May Grünwald-Giemsa. Se evaluó AH en pocillos de una placa de microtitulación, se colocaron 50 µL de solución TCS(Tris-CaCl2-NaCl) a pH 7 y luego se agregó 50 µL de veneno o proteína purificada en los pocillo.Por último, solución al 3% de glóbulos rojos humanos delgrupo O Rh+ fueron añadidos a cada pocillo. Las lecturas se realizaron luego de una hora de incubación a temperatura ambiente. Los resultadosfueron clasificados en hemoaglutinación completa y no hemoaglutinación. El veneno fue sometido a ultracentrifugación, así se eliminaron moléculas depeso molecular inferior a 50 Kda, posteriormente se aplicó a una columna de intercambio anionico Q-FF. De esta manera se realizo la separación de lasproteínas que a pH 8 presentaban una carga neta positiva primer pico de las negativas que se representaron con tres picos en el cromatograma.Todas las fracciones de elución fueron testeadas con ensayos para determinar actividad hemoaglutinante y agregante plaquetaria. Solo las primerasfracciones fueron positivas evidenciado la presencia de lectinas. Dado que la proteína de interés eluyó en el pico A se puede preveer que estapresenta un punto isoeléctrico superior a 8 por no ser retenida en la columna cargada positivamente en un medio tamponado a pH 8. Cada fracción deelución fue sometida a electroforesis por SDS-PAGE. Las muestras correspondientes al primer pico, no retenido por la columna, presentaron dosbandas superiores a 97 KDa. Estos hallazgos coinciden con estudios realizados por otros autores donde se reporta una lectina de 110 KDacompatible con un comlejo (Alfa-Beta)4. Adicionalmente se evidencian bandas de bajo peso molecular aprox. 14KDa, si se tienen en cuenta que lasolución de veneno fue en primera medida sometida a un proceso de ultrafiltraciones eliminando las proteínas de bajo peso molecular (50KDa) esaltamente probable que sean parte de la estructura cuaternaria de las moléculas de alto peso molecular. Por esto concluimos que la combinación dedos métodos de separación de proteínas, ultrafiltración e intercambio anionico, condujo a la obtención un extracto rico en proteínas compatiblesconvulxina (aprox. 100 kDa). Sin embargo, resta confirmar si las bandas que se visualizan en la SDS-PAGE de masa molecular del orden de 15 kDason cadenas pertenecientes a la proteína oligomérica ó si son extrañas a esta lectina de interés.