Regulación de ATP extracelular de Escherichia coli

N LAURI, CL ALVAREZ, S BADORREY, LD NIEVEZ, G CORRADI Y PJ SCHWARZBAUM

Buenos Aires

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Fisiología 2014; 2014

Introducción: Varios tipos celulares y microorganismos liberan ATP de manera no lítica al medio extracelular. La acumulación temporal de ATP extracelular (ATPe) depende del balance dinámico entre liberación de ATP y su hidrólisis extracelular por medio de ectonucleotidasas. Objetivo: En este trabajo se estudió la regulación de ATPe de Escherichia coli expuestas al péptido mastoparan 7 (MST7). Materiales y métodos: Las bacterias (DH5α) fueron crecidas overnight en medio LB a 37°C y agitación (300 rpm). A partir de este cultivo saturado se realizó un subcultivo (1:10) en las mismas condiciones por 2 horas. Luego se lavaron las células con medio M9 (Na2HPO4 42.3mM; KH2PO4 22.1 mM; NH4Cl 18.7 mM; MgSO4 0.007 mM; NaCl 108 mM y CaCl2 0.1 mM; pH 7) resultando una suspensión de 2 109 células/ml. La concentración de ATPe fue evaluada por luminiscencia colocando 10 μL de la suspensión de bacterias con 30 μl de mezcla Luciferina-Luciferasa. La luminiscencia producida por esta reacción, proporcional a la cantidad de ATP del medio, fue registrada a lo largo del tiempo y transformada a valores de ATP por medio de una curva de calibración (ATP 5-400 nM) antes y después del tratamiento con MST7 10 µM. La velocidad de hidrólisis de ATPe (actividad ectoATPasa) se evaluó en suspensiones de bacterias (2 109 células/ml) mediante la liberación de [γ32P]Pi a partir de [γ 32P]ATPe a 20 °C con 100, 200, 600 y 1000 nM de ATP. La determinación de la velocidad máxima de hidrólisis fue realizada con 500 μM de ATP. Resultados: En ausencia de estímulo, la [ATPe] se mantuvo constante en el tiempo en 2.03 ± 0.42 nM/106 cél (N=5, n=10, Fig 1). La exposición a 10 µM MST7 produjo un aumento no lineal agudo que alcanza un valor de 5.83 ± 0.66 nM/106 cél (N=5, 5=10) en el primer minuto, resultando una tasa de liberación de ATP de 0.15 pmol/106 cél/min(Fig1). La actividad ectoATPasa fue 2.6 10-5 pmol/106cél/min a 100 nM ATPe, 4.2 10-4 pmol/106cels/min a 1 µM ATPe (N=3, n=6) y 2.17 10-2 pmol/106cels/min a 500 μM ATPe (N=4, n=7)(Fig 2). El tratamiento con MST7 no afectó la viabilidad (Fig 3). La concentración intracelular de ATP medida por luminiscencia a través del lisado de las células por deshidratación, fue 0.79 ± 0.21 mM. Conclusión: En conclusión, se observa una liberación de ATPe por MST7. Esta liberación es muy baja en relación al contenido de ATPi de E. coli y por lo tanto no representa un compromiso energético para la célula. Además, se observa que la actividad ectoATPasa en el rango nM es baja con respecto a la tasa de liberación de ATP. Esto significa que la regulación de ATPe está determinada mayormente por la liberación del nucleótido al medio extracelular. Con subsidios UBACYT (20020100100090), CONICET (PIP1187 y PIP 639) y ANPCyT (0151).