CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

El vector pTcINDEX permite inducir la expresión de genes específicos en Trypanosoma cruzi (Taylor and Kelly, 2006). Es un vector integrativo con un sitio de expresión inducible bajo control de un promotor T7 regulable por Tetraciclina. El sistema Gateway se basa en el clonado por recombinación sitio específica y de esta manera permite trasladar un gen de interés (clonado en un vector de entrada) a múltiples vectores de destino de manera rápida y eficiente. Mediante la inserción el ?blunt? de un cassette de de conversión de vectores a este sistema (Gateway Vector Conversion System, Invitrogen) fue posinle transformar el plásmido pTcINDEX en un plásmido de salida Gateway: .pTcINDEX-GW. Para verificar que el vector construido funciona correctamente se transfirió por recombinación la proteína fluorescente verde (GFP) (previamente clonada en el vector de entrada pENTR3C) al pINDEX-GW y se transfectaron epimastigotes de la cepa Dm28c pLew13. Una vez obtenidos los parásitos transfectantes estables se realizaron curvas de crecimiento con distintas concentraciones de Tetraciclina, observándose que el crecimiento de los parásitos inducidos no difiere de el de los no inducidos, siendo sus tiempos de duplicación similares en todas las condiciones ensayadas. Además, se realizaron ensayos de western blot con anticuerpos anti-GFP a distintos tiempos de inducción para evaluar la expresión de GFP. Pudimos observar que la cantidad de proteína aumenta al aumentar el tiempo de inducción, manteniéndose estable entre las 48 y 72 horas post agregado de Tetraciclina. Por otro lado evaluamos la sobre expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia observándose resultados similares. La construcción del vector pTcINDEX-GW es una herramienta valiosa que permite optimizar el tiempo requerido para realizar los clonados y se suma a los vectores Gateway para T. cruzi previamente: pTEX-TAPtag-GW y pTREX-TAPtag-GW.

enviar mensaje