DETERMINACIÓN DE UN AMINOÁCIDO ESENCIAL PARA LA REPLICACIÓN/TRANSCRIPCIÓN EN LA REGION N-TERMINAL DE 3A

CM LOTUFO; M WILDA; PR GRIGERA; NM MATTION

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología ALAM-CAM 2016, IV Congreso Latinoamericano de Microbiología de Medicamentos y Cosméticos; 2016

Asociacion Argentina de Microbiologia

La fiebre aftosa es una enfermedad vesicular aguda que afecta a animales rumiantes biungulados, de amplio rango de huesped y rápida propagación. El agente causal es el virus de la fiebre aftosa (VFA), un virus no envuelto con genoma ARN de polaridad positiva perteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para 4 proteínas estructurales y 8 proteínas no estructurales, entre estás últimas se encuentra la proteína 3A de 153 aa de longitud. Esta posee un dominio hidrofóbico N-terminal (aa 25-44) y un dominio hidrofóbico transmembrana (aa 57-76). Se cree que 3A juega un papel relevante en la síntesis del ARN y en el anclaje a membranas intracelulares del complejo replicativo, como también en el grado de virulencia y rango de huésped del VFA.Identificar en 3A dominios involucrados en la replicación/transcripción a través de mutaciones generadas sobre el correspondiente gen, utilizando un replicón, que pueda ser usado en laboratorios de seguridad mínima, y permita el estudio de componentes de replicación y transcripción viral.Se diseñó y construyó un replicón plasmídico basado en una copia de ADN del genoma completo del VFA de la cepa O1/Campos, en el cual se le reemplazaron las proteínas capsidales por el gen reportero de la luciferasa de luciérnaga (pRep), bajo regulación del promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Como control de la actividad replicativa de pRep, se construyó un replicón defectivo del mismo por medio de una deleción de 1 nt la cual genera un transcripto no funcional (pRepD). Para la medición de la actividad luciferasa del replicón y su control células BHK-21 se cotransfectaron con los plásmdos pRep o pRepD junto con los plásmidos que expresan T7 polimerasa y luciferasa renila (normalizador). Se obtuvieron lisados celulares 16hs post-transfección y la actividad luciferasa (luciérnaga y renila) de los mismos se midió utilizando el Dual-Luciferase Assay System? (Promega) con un luminómetro BioTek FLx800. Para el estudio de 3A se realizaron deleciones sobre pRep en la región que codifica para el extremo N terminal, resultando las mutantes: p∆6-11, p∆6-17 y p∆6-23, y posteriormente mutaciones puntuales en la región que disminuyó significativamente la actividad luciferasa. Estas construcciones fueron evaluadas junto con pRep y su control pRepD. Se logró la construcción del Replicón del VFA O1/Campos con capacidad de trascripción/replicación medible a través de la actividad luciferasa. Las mutantes p∆6-11 y p∆6-17 presentaron actividades de luciferasa similares a pRep, sugiriendo que la región comprendida entre los aa 6 a 17 de 3A no sería necesaria para la funcionalidad del mismo. Por el contrario, p∆6-23 presentó una marcada disminución en dicha actividad indicando un probable requerimiento de los aa 18 a 23 de 3A para la replicación/transcripción. A partir de estos datos se crearon las mutantes pQ18AH19AE20A y pE20A, en la primera obteniendo una región de alaninas del 18 al 23 y la segunda reemplazando solo el único aa con carga negativa de la zona por una alanina. Ambas mutantes disminuyeron significativamente la funcionalidad del sistema. Indicando que el Ácido Glutámico ubicado en la posición 20 de la proteína 3A resultaría esencial para la replicación del sistema.