Uso del Inmunoblot (Western Blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3: tres proteínas de relevancia en diagnóstico de miopatías hereditarias

SORROCHE, PB; CUCCI, M; WILDA M; RUGGIERO, MF; BETTINI, M; GIMÉNEZ, M; CHRISTIANSEN, S; GRIGERA, PR

Bioquímica y Patología Clínica

Asociación Bioquímica Argentina

Año: 2016 vol. 80 p. 28 - 33

1515-6761

La ausencia y/o disfunción de 3 proteínas constitutivas del músculo, distrofina(UniProtKB - P11532) en el caso de las distrofinopatías y disferlina(UniProtKB - O75923) y calpaina 3(UniProtKB - P20807) en las distrofias de caderas, juegan un papel central en la etiología de estas miopatías hereditarias. La con-firmación de su presencia o ausencia en biopsias musculares es de relevancia diagnóstica y marca la ne-cesidad de contar en el laboratorio clínico hospitalario con una técnica sensible y específica, que permita la detección e identificación de estas tres proteínas en nuestras de pacientes. Desarrollar un protocolo de inmunoblot(Western blot, WB) adaptable al laboratorio de análisis clínicos hospitalario, para la detección de 3 proteínas constitutivas del musculo; distrofina, disferlina y calpaína 3 en material extraído de biopsias de pacientes. App 20-40 mg de biopsia muscular es desnaturalizada en presencia de detergente SDS y mercaptoetanol por 10 minutos a 100Co , analizadas en PAGE / SDS en formato mini-gel seguido de transfe-rencia a membranas de nitrocelulosa e incubación con anticuerpos monoclonales(MAbs) con reactividad específica para las tres proteínas musculares mencionadas y revelado cromogénico y/ o quimiolumínico. El protocolo presentado permite el análisis de un amplio rango de pesos moleculares que incluye a las 3 proteínas de interés: distrofina(430Kd), disferlina(250 Kd) y calpaina 3(95 Kd). La detección e identifica-ción está basada tanto en la determinación del peso molecular relativo como en la reacción uníivoca con anticuerpos monoclonales específicos. En el caso de Calpaína 3 la técnica es capaz de detectar e identificar fragmentos de auto procesamiento en el rango de 55-60 Kd, un dato indicativo no solo de la presencia y expresión del respectivo gen sino también de la funcionalidad de su producto. Se discute la conveniencia de utilizar quimioluminiscencia o cromógenos en el revelado del WB.