EXPRESIÓN DE CASPASA 3 ACTIVA DURANTE LA MEIOSIS EN COLUMBA LIVIA (AVES: COLUMBIFORMES)

OLEA GABRIELA; AGUIRRE MA. VICTORIA; TODARO SANTIAGO; STOYANOFF TANIA; LOMBARDO DANIEL

BUENOS AIRES

Jornada; V Jornadas Internacionales de Instituto de Reproducción Animal (INITRA); 2017

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES-FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

Las caspasas 3, 6 y 7 constituyen el grupo de caspasas efectoras y son las responsables de la fase de ejecución de la apoptosis, sin embargo algunos autores asocian a la caspasa 3 activa con eventos de proliferación y diferenciación celular. En el presente trabajo a fin de establecer el rol de dicha proteina durante los eventos de diferenciación ovárica y meiosis en Columba livia (Aves: Columbiformes) se procedió a la detección por inmunohistoquímica (IHQ) de la proteína caspasa 3 activa. Para ello se reveló en preparados histológicos de C. livia correspondientes a los estadios (E) 40 a 14 dias post-eclosión (dpe) la expresión de caspasa 3 activa, utilizando un anticuerpo anti caspasa 3 activa de Sigma (C8487) producido en conejo en una concentración de 1:600 a 4C ON y revelados según el protocolo indirecto de ?L-streptoavidina biotina?. La expresión de dicha proteina se examinó a nivel cuantitativo a través de Western Blot (WB), para ello se sembró en gel de poliacrilamida al 12% en una cantidad de 40 μG de proteínas por calle. Se corrieron las muestras por 2 hs a 40 mA. La transferencia de las proteínas a membranas de nitrocelulosa de 0,2 μm de poro (162-0147 Bio-Rad), se realizó a 40V ON a 4 ºC. Se controló la transferencia por tinción con Rojo Punceau y se conservaron las membranas a -20 ºC hasta su incubación con los anticuerpos anticaspasa 3 (Cell Signal Co). Luego del revelado, las membranas se lavaron con PBS y se conservaron a - 20 ºC hasta su incubación con el anticuerpo anti ß-actina (control de masa). Las membranas fueron tratadas con NaOH 2N durante 5 minutos para levantar los anticuerpos antes de bloquear e incubar las mismas con anti ß-actina, utilizada como referencia de expresión basal de proteínas. Por IHQ dicha molécula se expresó en el ovario izquierdo a partir del E41. Se detectaron células de la línea germinal en la corteza y médula de la gónada izquierda y dispersas en la médula de la gónada derecha. En contraste, las ovogonias dispersas en la gónada derecha, no expresan caspasa 3 activa, lo que indica que estas, en la gónada derecha, no entran en meiosis. La expresión de caspasa 3 activa en las ovogonias en división permite inferir que dicha molécula estaría involucrada durante la ontogenia gonadal en los procesos de división celular. Mediante el WB se detectó un incremento en la expresión de la caspasa 3 a partir del E41, indicando el inicio de la meiosis en este momento. Tomados en conjunto con los resultados de IHQ, estos datos indican que caspasa 3 activa se expresa en los ovarios embrionarios a partir del E41 y su expresión se incrementa gradualmente, y de forma concomitante al incremento de células de la línea germinal que entran en meiosis. Por lo que, caspasa 3 activa no es reguladora clave de la apoptosis en las gónadas de C. livia dado que la inmunodetección positiva está asociada a células de la línea germinal en diferenciación.