CARACTERIZACIÓN HISTOQUIMICA DEL TEGUMENTO EN RAYAS DEL RIO PARANÁ (Potamotrygon motoro)

PEREZ DANTE; GONZALEZ FRANCO; OLEA GABRIELA; FLORES QUINTANA CAROLINA

Buenos Aires

Jornada; X Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2023

-INTRODUCCIÓN:Las rayas son animales venenosos que provocan accidentes en animales de otras especies y en humanos (GARRONE-NETO et al., 2010). Se encuentran importantes representantes de la familia Dasyatidae y Potamotrygonidae, esta última perteneciente al medio dulceacuícola (CHARVET et al., 2002; CARVALHO et al., 2003). Por ser de hábito bentónico, se entierran en el sustrato y al ser pisadas en la región dorsal, giran la cola que contiene el aguijón hacia el agresor introduciendo el mismo. Las picaduras provocan una intensa acción inflamatoria (ANTONIAZZI et al., 2011). Esto probablemente ocurre porque el mismo contiene serraciones en sus laterales además de células venenosas presentes en toda la región del tegumento (CARVALHO et al., 2003). Todo accidente provocado por los peces se denomina ictismo, que puede ser sarcotóxico, es decir, por la ingestión de toxinas presentes en los órganos y en el propio tegumento del animal, o acantotóxico cuando es por mordedura o picadura, siendo este último mecanismo utilizado por las rayas (FUNASA et al., 2001). Estos animales se caracterizan por la presencia de uno a tres aguijones mineralizados en la cola, que están cubierta por células epidérmicas y células que secretan el veneno que en contacto con personas o animales producen grandes lesiones (PEDROSO et al., 2007). Por lo antes expuesto el presente estudio tuvo como objetivo analizar las características del tegumento de Potamotrygon motoro a nivel Histológico, Histoquímico, Inmunohistoquimico y Microbiológico a fin de caracterizar la estructura del mismo y sus glándulas asociadas.-MATERIALES Y MÉTODOS:Obtención del material: El muestreo se realizó en cercanías a la localidad de Corrientes Capital, a orillas del Rio Paraná, provincia de Corrientes, República Argentina. Se colectaron un total de 7 ejemplares. Los mismos fueron muestreados a partir de pesca directa o redes de malla. Análisis de los individuos: se realizó la biopsia de cada ejemplar con lupa estereoscópica; y se aislaron fragmentos del tegumento del dorso y cola del animal con saca bocado, para colectar 4 fragmentos de la región dorsal del tegumento, previa anestesia con Lidocaína al 2%, las mismas fueron colocadas en casetes individuales, fijados en formol bufferado al 10%.. Los mismos fueron observados bajo lupa estereoscópica y microscopio electrónico de barrido (MEB). La preparación de los ejemplares para MEB se realizó siguiendo el protocolo estandarizado de deshidratación en soluciones de concentración creciente de Acetona, secado a punto crítico y metalizado con oro. Análisis histológico: con los fragmentos de tegumento se procedió a la elaboración de preparados histológicos siguiendo las técnicas convencionales de deshidratación, inclusión en parafina y coloración. Las muestras fueron coloreadas con Hematoxilina-Eosina y de esta manera se analizaron las estructuras celulares y glandulares presentes en el tegumento, con Tricrómica de Mallory a fin de poner de manifiesto la presencia de las fibras de colágeno y reacción histoquímica de PAS para detectar positividad de dichas glándulas y analizar la naturaleza química de sus componentes. Las imágenes fueron capturadas mediante el uso de una cámara acoplada a un microscopio trinocular.Analisis Inmunohistoquímico: Se reveló la expresión del antígeno de proliferación celular PCNA con la finalidad de detectar eventos de proliferación celular en el tegumento. Para ello se utilizó como anticuerpo primario PCNA origen conejo anti ratón. El revelado se realizó con el kit de DAKO (K3468) a temperatura ambiente.Análisis del perfil microbiológico: A fin de conocer su microbiota natural y/o patógena, se remitió al Laboratorio de Química Aplicada de FACENA muestras de la secreción de las glándulas de veneno de Potamotrygon motoro provenientes de 3 individuos adultos para identificación de microorganismos. Las mismas fueron tomadas mediante punción aspiración y por hisopado. Para el momento del, transporte se utilizó un medio de transporte Stuart. Luego se procedió a la siembra en los medios Agar-Sangre, para permitir el crecimiento de todos los microorganismos con importancia y Agar Levine, medio diferencial y selectivo para muestras mixtas. Se las llevo a estufa a 37 °C. A las 24 h se visualizó el crecimiento de los microorganismos. Se realizó una coloración de Gram para observar la morfología. Se utilizaron diferentes pruebas para la posterior tipificación de los microorganismos: la prueba de la catalasa, de hemólisis, de hidrólisis de pyr, coagulasa, TSI, SIM, citrato, urea, lisina hierro agar. -RESULTADOS Y DISCUSIÓN:Se observa que el tegumento está conformado por un tipo de escamas de forma poligonal denominas placoides, estas solo se pueden observar en rayas y tiburones (Fig.1 A). Microscópicamente se observan numerosos orificios o también denominadas poros, los cuales son los espacios por donde se secreta el contenido de las celulas productoras del veneno y otras glándulas asociadas (Fig.1 B). En las muestras tomadas de la región de la cola se pueden observar unas hileras de espinas de distintos tamaños (Fig.1 C), y más hacia la región caudal de la cola podemos encontrar el aguijón (vulgarmente conocido con el nombre de chuza), su punta es afilada y en sus bordes laterales se pueden observar la presencia de serraciones, la misma actuaría como instrumento de lesión al momento en el que animal reaccione por temor o defensa (Fig.1 D). Análisis histológico: histológicamente se observó que el tegumento se encuentra constituido por una epidermis, dermis e hipodermis (Fig 1. E, F, G). La epidermis constituida de epitelio plano estratificado no queratinizado podemos encontrar mayoritariamente células epiteliales las cuales poseen una forma redonda y se localizan en la zona basal y apical del tegumento, en la zona intermedia encontramos otros tipos celulares. La misma está separada de la dermis por una fina membrana la cual no contiene células, denominada membrana basal. La dermis constituida principalmente por fibroblastos y fibras de tejido conectivo, la cual provee un medio de sostén. Cumple con la función de soporte de la piel, además de aportar la nutrición necesaria a la epidermis (Fig.1 E, G). También se pudieron observar algunas escamas, las mismas se originan en la dermis, y están cubiertas por la epidermis (Fig.1 F). Las células secretoras del veneno localizadas también en el epitelio de la epidermis tienen una forma alargada y presentan vesículas fusiformes en el interior de su citoplasma (Fig.1 H). Estas celulas se pueden encontrar a lo largo de todo el tegumento de dicha especie, pero mayoritariamente se distribuyen en mayor cantidad cerca de la región dorsal de la cola, en proximidades al aguijón. Además podemos encontrar células epiteliales no especializadas en la producción de veneno (Fig.1 I), estas tienen una forma redondeada y se caracterizan por ser células mucosas de un diámetro promedio de 60 um, contienen muchos gránulos secretores en su citoplasma que se encargan de secretar mucus compuesto principalmente por mucopolisacaridos el cual fue evidenciado mediante la técnica de coloración PAS (Fig.1 I). Otro tipo de estructura encontradas en el epitelio de estos animales son las glándulas secretoras o también conocidas como células en botella porque tienen una forma alargada y una conexión con el exterior del epitelio, pero en general son glándulas grandes que contienen hialinas, con un diámetro promedio de 100 um (Fig.1 J). Analisis Inmunohistoquimico: Se pudo inmunodetectar la proliferación de las celulas presentes en el epitelio, tanto celulas productoras del veneno, como celulas mucosas, dicho evento se evidenció a partir de la inmunodetección positiva de la proteína de proliferación celular PCNA en los núcleos de dichas celulas (Fig.1 L, M).El mayor número de celulas positivas se vio en el estrato basal de la epidermis; ya que la zona apical es donde se produce el continuo recambio celular (Fig.1K). Analisis del Perfil Microbiológico: a las 24 horas se observó el crecimiento de microorganismos Beta-hemolíticos (Fig.1 N). Todas las cepas fueron visualizadas con tinción Gram para determinar su morfología, características tintoriales y agrupación. Se observaron bacilos Gram negativos. Los resultados de las pruebas de tipificación de presentan en la tabla 2. PRUEBASGRAMCATALASAOXIDASATSISIMDNASACITRATOLISINAHIERROAGARCOMPATIBLE CONMUESTRAS DE TEGUMENTOBACILOSGRAM NEGATIVOPOSITIVAPOSITIVAA/ANEGATIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVOK/AAeromona spp.Tabla 2: resultados de la prueba de tipificaciónEl presente trabajo permitió evidenciar que Potamotrygon motoro presenta un sistema tegumentario semejante al descripto para otras especies de rayas, tanto las de agua dulce como las de agua salada. La ubicación y características externas de la piel coinciden con lo descripto por otros autores para las rayas de rio. (DEHGHANI et al ., 2010; PEDROSO et al ., 2007). -CONCLUSIONES:Estos resultados demuestran que en las rayas del género Potamotrygon las células y glándulas secretoras de veneno se distribuyen por todo el epitelio de la epidermis lo que demuestra que no existe una sola glándula como en serpientes. Esta distribución celular supone una estrategia de defensa además de estar relacionado con los ambientes donde habitan estos animales. Con respecto al analisis del perfil microbiológico podemos decir q las bacterias del género Aeromonas son consideradas autóctonas del medio acuático y han sido aisladas de ríos, lagos, agua de mar, agua potable y aguas residuales tratadas y no tratadas. Además este estudio permitirá realizar un análisis comparativo con ejemplares de diferentes edades y de otras especies, ya que según la bibliografía consultada este patrón tegumentario se repite en todas las especies de rayas y mantarrayas, a su vez se podrá determinar las características químicas del veneno, y como actúa a nivel muscular y sistémico.