Tesis Doctoral: Nuevas estrategias de inmovilización de ADN sobre diferentes electrodos. Caracterización de la capa adsorbida y aplicaciones para el desarrollo de biosensores

MARÍA LAURA PEDANO

Universidad Nacional de Córdoba

Lugar: Córdoba; Año: 2006 p. 433

El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo el desarrollo y caracterización de nuevas capas de biorreconocimiento basadas en el uso de ADN, con el fin de contribuir al diseño racional de nuevos biosensores electroquímicos de hibridación y para la detección de compuestos que interactúen con ADN. Se presentan nuevas metodologías de inmovilización de ácidos nucleicos sobre una amplia variedad de superficies sólidas y se caracterizan las interfaces formadas empleando diferentes técnicas. Particularmente, se muestran los resultados obtenidos con respecto a la adsorción y electrooxidación de ácidos nucleicos sobre distintos electrodos de carbono y el autoensamblado capa por capa de ds-ADN con derivados de quitosano sobre electrodos de oro. También se presenta la aplicación de un novedoso material de carbono, constituido por nanotubos de carbono aglutinados con aceite mineral, denominado pasta de nanotubos de carbono, para estudios relacionados con la adsorción y electrooxidación de ácidos nucleicos. En cuanto a los experimentos realizados sobre diferentes electrodos de carbono, se estudió el proceso de adsorción, electrooxidación e hibridación de ADN, al igual que la interacción de ADN con varios compuestos sobre carbono vítreo (GC), pasta de carbono vítreo (GCPE), pasta de grafito (gCPE). Los biosensores así obtenidos fueron caracterizados por técnicas electroquímicas, ópticas, espectroscópicas y microscópicas, como voltamperometría cíclica, voltamperometría de onda cuadrada, “stripping” pontenciométrico a corriente constante (PSA), elipsometría, espectroscopía UV-visible, resonancia de plasmón superficial (SPR), espectroscopía Raman, AFM y SEM. La adsorción de ADN sobre electrodos de carbono vítreo, pasta de carbono vítreo, y pasta de nanotubos de carbono, es un proceso complejo que depende de numerosos factores, como los pretratamientos realizados a la superficie e historia previa, la naturaleza y concentración del electrolito soporte, la presencia de iones monovalentes, el tiempo y potencial aplicado para la adsorción del ácido nucleico, la concentración, longitud de la secuencia, contenido de residuos guanina, y naturaleza de simple o doble hebra del ADN a inmovilizar. A partir del estudio sistemático de las diferentes variables que afectan el proceso de adsorción de ácidos nucleicos, se optimizaron la condiciones para la inmovilización de oligo (dG)21, oligo (dG)11, una porción del ADN del virus del SIDA, y ADN de simple (ss) y doble hebra (ds) de timo de ternera. Los electrodos de carbono estudiados se utilizaron para la detección y cuantificación directa de ácidos nucleicos, obteniéndose límites de detección del orden de las ppb. La caracterización de las capas de ADN adsorbidas en las distintas condiciones estudiadas, permitió inferir la morfología y propiedades de las mismas. De esta manera, se pudo comprender mejor el proceso de adsorción, las variables que lo afectan, y la naturaleza de las principales fuerzas involucradas, es decir, si la interacción del ADN con el sustrato es predominantemente hidrofóbica o electrostática. También se optimizaron las condiciones de autoensamblado capa por capa de ds-ADN con derivados de quitosano (quitosano cuaternario, quitosano sustituido un 5 % y un 25 % con residuos octilo), sobre electrodos de oro modificados con una monocapa de ácido 3-mercapto- 1-propansulfónico, que le confiere carga negativa a la superficie para permitir la adsorción electrostática inicial de los derivados de quitosano cargados positivamente al pH de trabajo. El crecimiento de las multicapas así formadas y la cinética de adsorción, fueron caracterizados empleando resonancia de plasmón superficial. En síntesis, la adsorción directa de ácidos nucleicos sobre electrodos de carbono, ofrece una alternativa rápida y sumamente sencilla para la inmovilización de los mismos con vista a la construcción de plataformas de biorreconocimiento. La formación de multicapas autoensambladas de ds-ADN con derivados del polisacárido natural quitosano, brinda un entorno biocompatible para preservar la estructura del ds-ADN inmovilizado, al mismo tiempo que posibilita la adsorción de una mayor cantidad de ADN sobre la superficie, lo que permitiría mejorar los niveles de preconcentración y por lo tanto los límites de detección que se podrían alcanzar al emplear dicha capa de reconocimiento en un biosensor. El presente trabajo de tesis constituye un aporte al conocimiento de las propiedades y características de los depósitos de ácidos nucleicos sobre superficies de carbono y oro, lo que podrá traducirse en un diseño racional de biosensores de afinidad que permitan la cuantificación de secuencias genéticas de interés médico o forense, así como también la detección de compuestos capaces de producir algún daño en el ADN. condiciones estudiadas, permitió inferir la morfología y propiedades de las mismas. De esta manera, se pudo comprender mejor el proceso de adsorción, las variables que lo afectan, y la naturaleza de las principales fuerzas involucradas, es decir, si la interacción del ADN con el sustrato es predominantemente hidrofóbica o electrostática. También se optimizaron las condiciones de autoensamblado capa por capa de ds-ADN con derivados de quitosano (quitosano cuaternario, quitosano sustituido un 5 % y un 25 % con residuos octilo), sobre electrodos de oro modificados con una monocapa de ácido 3-mercapto- 1-propansulfónico, que le confiere carga negativa a la superficie para permitir la adsorción electrostática inicial de los derivados de quitosano cargados positivamente al pH de trabajo. El crecimiento de las multicapas así formadas y la cinética de adsorción, fueron caracterizados empleando resonancia de plasmón superficial. En síntesis, la adsorción directa de ácidos nucleicos sobre electrodos de carbono, ofrece una alternativa rápida y sumamente sencilla para la inmovilización de los mismos con vista a la construcción de plataformas de biorreconocimiento. La formación de multicapas autoensambladas de ds-ADN con derivados del polisacárido natural quitosano, brinda un entorno biocompatible para preservar la estructura del ds-ADN inmovilizado, al mismo tiempo que posibilita la adsorción de una mayor cantidad de ADN sobre la superficie, lo que permitiría mejorar los niveles de preconcentración y por lo tanto los límites de detección que se podrían alcanzar al emplear dicha capa de reconocimiento en un biosensor. El presente trabajo de tesis constituye un aporte al conocimiento de las propiedades y características de los depósitos de ácidos nucleicos sobre superficies de carbono y oro, lo que podrá traducirse en un diseño racional de biosensores de afinidad que permitan la cuantificación de secuencias genéticas de interés médico o forense, así como también la detección de compuestos capaces de producir algún daño en el ADN.21, oligo (dG)11, una porción del ADN del virus del SIDA, y ADN de simple (ss) y doble hebra (ds) de timo de ternera. Los electrodos de carbono estudiados se utilizaron para la detección y cuantificación directa de ácidos nucleicos, obteniéndose límites de detección del orden de las ppb. La caracterización de las capas de ADN adsorbidas en las distintas condiciones estudiadas, permitió inferir la morfología y propiedades de las mismas. De esta manera, se pudo comprender mejor el proceso de adsorción, las variables que lo afectan, y la naturaleza de las principales fuerzas involucradas, es decir, si la interacción del ADN con el sustrato es predominantemente hidrofóbica o electrostática. También se optimizaron las condiciones de autoensamblado capa por capa de ds-ADN con derivados de quitosano (quitosano cuaternario, quitosano sustituido un 5 % y un 25 % con residuos octilo), sobre electrodos de oro modificados con una monocapa de ácido 3-mercapto- 1-propansulfónico, que le confiere carga negativa a la superficie para permitir la adsorción electrostática inicial de los derivados de quitosano cargados positivamente al pH de trabajo. El crecimiento de las multicapas así formadas y la cinética de adsorción, fueron caracterizados empleando resonancia de plasmón superficial. En síntesis, la adsorción directa de ácidos nucleicos sobre electrodos de carbono, ofrece una alternativa rápida y sumamente sencilla para la inmovilización de los mismos con vista a la construcción de plataformas de biorreconocimiento. La formación de multicapas autoensambladas de ds-ADN con derivados del polisacárido natural quitosano, brinda un entorno biocompatible para preservar la estructura del ds-ADN inmovilizado, al mismo tiempo que posibilita la adsorción de una mayor cantidad de ADN sobre la superficie, lo que permitiría mejorar los niveles de preconcentración y por lo tanto los límites de detección que se podrían alcanzar al emplear dicha capa de reconocimiento en un biosensor. El presente trabajo de tesis constituye un aporte al conocimiento de las propiedades y características de los depósitos de ácidos nucleicos sobre superficies de carbono y oro, lo que podrá traducirse en un diseño racional de biosensores de afinidad que permitan la cuantificación de secuencias genéticas de interés médico o forense, así como también la detección de compuestos capaces de producir algún daño en el ADN. condiciones estudiadas, permitió inferir la morfología y propiedades de las mismas. De esta manera, se pudo comprender mejor el proceso de adsorción, las variables que lo afectan, y la naturaleza de las principales fuerzas involucradas, es decir, si la interacción del ADN con el sustrato es predominantemente hidrofóbica o electrostática. También se optimizaron las condiciones de autoensamblado capa por capa de ds-ADN con derivados de quitosano (quitosano cuaternario, quitosano sustituido un 5 % y un 25 % con residuos octilo), sobre electrodos de oro modificados con una monocapa de ácido 3-mercapto- 1-propansulfónico, que le confiere carga negativa a la superficie para permitir la adsorción electrostática inicial de los derivados de quitosano cargados positivamente al pH de trabajo. El crecimiento de las multicapas así formadas y la cinética de adsorción, fueron caracterizados empleando resonancia de plasmón superficial. En síntesis, la adsorción directa de ácidos nucleicos sobre electrodos de carbono, ofrece una alternativa rápida y sumamente sencilla para la inmovilización de los mismos con vista a la construcción de plataformas de biorreconocimiento. La formación de multicapas autoensambladas de ds-ADN con derivados del polisacárido natural quitosano, brinda un entorno biocompatible para preservar la estructura del ds-ADN inmovilizado, al mismo tiempo que posibilita la adsorción de una mayor cantidad de ADN sobre la superficie, lo que permitiría mejorar los niveles de preconcentración y por lo tanto los límites de detección que se podrían alcanzar al emplear dicha capa de reconocimiento en un biosensor. El presente trabajo de tesis constituye un aporte al conocimiento de las propiedades y características de los depósitos de ácidos nucleicos sobre superficies de carbono y oro, lo que podrá traducirse en un diseño racional de biosensores de afinidad que permitan la cuantificación de secuencias genéticas de interés médico o forense, así como también la detección de compuestos capaces de producir algún daño en el ADN.