GelLC-MS/MS como complemento del análisis proteómico en solución

BONILLA JOSE; PAEZ DANIELA; CALLEGARI EDUARDO; MAGALLANES NOGUERA CYNTHIA; KURINA SANZ MARCELA

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

El concepto de rango dinámico analítico aplicado a la proteómica, permite comprender las limitaciones al momento de identificar la mayor cantidad de proteínas posible en una muestra, cuando la diferencia de concentración entre ellas es muy grande. Existen diferentes estrategias para abordar esta limitación, que se deben llevar a cabo a modo de pre-enriquecimiento de las muestras, previo a su procesamiento y posterior análisis por cromatografía líquida (LC) acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Una de esas estrategias puede ser el uso de GelLC-MS/MS en combinación con el procesamiento en solución.El objetivo del presente trabajo es comparar los resultados obtenidos al analizar los perfiles de proteínas intracelulares de raíces transformadas de Brassica napus, un organismo capaz de remover colorantes azoderivados, empleando análisis en solución y GelLC-MS/MS, como así también la combinación entre ambas técnicas.Las proteínas se obtuvieron a partir de 1 g de raíces de B. napus, cultivadas en ausencia (Muestra A) y en presencia (Muestra B) del colorante Naftol Azul-Negro, a través de extracción con fenol complementado con SDS y tratamientos de sonicación1. Las muestras se dividieron en dos alícuotas: una para realizar análisis en solución y la otra para ser analizada por GelLC-MS/MS2. Para ello, luego de la separación por SDS-PAGE, cada calle del gel se dividió en nueve porciones iguales. En ambos casos, la reducción y alquilación de las proteínas se llevó a cabo utilizando DTT y Iodoacetamida, y la digestión se realizó con Tripsina. Luego, los péptidos trípticos se concentraron, separaron y analizaron por LC de Ultra Performance en escala nano (EASY-nLC™ 1200, Thermo Fisher Scientific), acoplada a MS/MS con una fuente de ionización Electrospray escala nano (nanoESI-MS/MS; Orbitrap Exploris™ 240, Thermo Fisher Scientific). La lista de masas y picos genéricos se obtuvo con Proteome Discoverer v2.5 (Thermo Fisher Scientific) acoplado a Mascot v2.8.1 (licencia local, www.matrixscience). Se utilizó como base de datos la correspondiente a B. napus v20220629 (139.334 secuencias; 47.116.931 residuos, www.uniprot.org). El estudio comparativo se llevó a cabo con ProteoIQ v2.8 (www.premierbiosoft.com). Se trabajó con triplicados biológicos y duplicados analíticos.En la Muestra A se identificaron 8.186 proteínas en el análisis en solución, 7.411 proteínas por GelLC-MS/MS y 11.118 al combinar ambas técnicas. En cuanto a la reproducibilidad experimental, se observó una baja dispersión de datos en solución entre los tres replicados, mientras que se observó una buena correlación en al menos dos de los tres replicados al emplear GelLC-MS/MS y al combinar los datos de GelLC-MS/MS + en solución. En la Muestra B, se identificaron 9.056 proteínas en solución, 10.720 a través de GelLC-MS/MS y 13.501 al combinar ambas técnicas. Al igual que en la Muestra A, se observó una excelente correlación en los replicados al emplear análisis en solución, y muy buena reproducibilidad en al menos dos de tres réplicas al emplear GelLC-MS/MS y al combinar ambas técnicas. A partir de estos resultados, se puede concluir que emplear GelLC-MS/MS como complemento del análisis en solución permite identificar un mayor número de proteínas en las muestras, asegurando una buena correlación entre los datos obtenidos.