Validación de un método para la determinación de steviósidos totales en muestras comerciales

ARAGÓN, LESLIE; VICARIO, ANA; SAIDMAN, ELBIO; DI CHIACCHIO, GABRIELA; GOMEZ, MARÍA ROXANA

Guatemala

Simposio; SIMPOSIO IBEROAMERICANO EN LÍNEA COIFFA 2022 SALUD GLOBAL Y SOSTENIBILIDAD; 2022

INTRODUCCIÓN: Stevia rebaudiana (stevia), es una hierba originaria de Paraguay, actualmente cultivada en diversos países alrededor del mundo. El mayor valor de esta planta está en los fitoquímicos dulces que se extraen de sus hojas llamados glicósidos de steviol (o steviolglicósidos). El steviósido tiene un ligero sabor amargo y proporciona 250 a 300 veces el dulzor del azúcar. Las hojas de la planta silvestre de stevia contienen 0,3% Dulcósido, 0,6% Rebaudiósido C, 3,8% Rebaudiósido A y el 9,1% de Esteviósido Los Steviósidos de stevia han sido aprobados por el Comité Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios de la FAO/OMS, en el año 2008 para ser utilizados como aditivos y se emplean actualmente como edulcorantes en todo el mundo. El objetivo de este estudio fue realizar la validación de un método analítico para determinar del contenido de steviosidos totales presente en productos alimenticios comerciales. Las buenas prácticas de fabricación y control requieren que los métodos analíticos empleados para evaluar las especificaciones establecidas sean apropiados.Los atributos que se evaluaran son linealidad, precisión, exactitud, limite de detección, limite de cuantificación, especificidad y robustez.METODOLOGÍA: La validación de un método analítico es el proceso por el cual se establece, por medio de estudios de laboratorio, que un método es apropiado para el uso propuesto.Se aplicó una técnica de Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC) desarrollada por Woelwer Rieck y colaboradores, utilizando un Dionex Ultimate 3000 (ThermoScientific) compuesto por un inyector automático, un detector DAD y horno. El sistema cromatográfico consistió en una columna: Luna NH2 de 250 x 4,6 mm 5μm; Fase móvil: Acetonitrilo/agua (75:25); Detector: DAD a 210 nm; Horno: 36°C; Volumen de Inyección: 20 μl; Velocidad de Flujo: 1,2 ml/min.Se utilizo como sustancia de referencia steviosido Sial (≥96%) y como muestras dos marcas comerciales en sobres con polvo edulcorante y materia prima de stevia con la que se producen estos productos. Las muestras y el patrón de referencia fueron disueltos en agua en concentraciones equivalentes a 20 mg de steviosido llevando a un volumen final de 100 ml en agua. Estas soluciones fueron inyectadas posteriormente en el cromatógrafo. RESULTADOS: Para la validación del método analítico aplicado se siguió los lineamientos indicados en el apartado 1130 (VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS) de la Farmacopea Argentina 7ma Ed. 2013.Los datos obtenidos de las variables se sometieron a análisis estadístico. Se organizaron las diferentes experiencias para llevar a cabo y evaluar las siguientes características del método propuesto. Linealidad e intervalo: se evaluó utilizando cinco concentraciones conocidas que van desde 2,5 µg/ml a 30 µg/ml obteniéndose resultados directamente proporcionales a la concentración de steviósidos totales en el intervalo dado, siendo el CV facto respuesta = 1,69% y R² = 0,9998.Precisión: se evaluó mediante el análisis de la repetibilidad realizando 10 mediciones individuales obteniéndose un CV=0,66% < 1,5% y la reproducibilidad realizando operaciones entre 2 analistas (A1 y A2) y en días diferentes de trabajo obteniéndose del estudio estadístico un Fexp(A1,A2): 3,33< Ftab(p:0,05): 5,05; t exp(A1,A2): 0,30 < t tab(p:0,05):2,228; CV(A1,A2): 0,29 < 3%. Fexp(D1,D2): 2,35 < Ftab(p:0,05): 5,05; t exp(D1,D2): 0,127 < t tab(p:0,05):2,228.Exactitud: se evaluó utilizando tres concentraciones 80%, 100%, 120% y por triplicado obteniéndose un CV=0,50% < 1,5%, t exp: 0,72 < t tab(p:0,05):2,306. El límite de detección (LOD) fue definido como la concentración de la referencia que corresponde a tres veces la relación señal/ruido (S/N=3) y el límite de cuantificación (LOQ) fue definido a la concentración de la referencia que correspondió a diez veces la relación señal/ruido (S/N=10). Especificidad: No se ve afectado por la presencia de otros ingredientes que componen el producto. Robustez: la metodología propuesta no se ve influenciada por variables operativas ni por el entorno sobre los resultados del ensayo.CONCLUSIONES. En la prueba de linealidad el coeficiente de variación de los factores de respuesta para steviósidos totales demuestra una adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido (CV