Clonado, expresión y caracterización de nuevos dominios LysM para el desarrollo de una plataforma con múltiples aplicaciones biotecnológicas.

MARÍA FERNANDA RAYA TONETTI; CARLA LUCIANA PADILLA FRANZOTTI; SACUR, JACINTO ALFREDO; JULIO CÉSAR VILLENA; MARÍA GUADALUPE VIZOSO PINTO

Simposio; V Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2018

IntroducciónElmotivo de lisina(LysM), ampliamente conservado en eucariotas y procariotas, seune específicamente al peptidoglicano. En Lactobacillusfermentum identificamos proteínas con estos dominios y seleccionamos unacon un único dominio LysM y otra con cinco con el objetivo de caracterizarlos respectoa su unión al peptidoglicano, identificar el de mayor capacidad de unión y construirun vector de destino (Gateway) que permita etiquetar proteínas con el dominio elegido.MetodologíaDosdominios LysM y LysM5 amplificados a partir del genoma de L. fermentum por PCR, fueron clonadospor recombinación (reacción BP, Gateway) en pENTR207. Luego, por una reacciónde recombinación (LR) con los sitios attR se los insertó en el vector destinopETGA-N-His-Venus[rfB]. En E. coliRosetta transformada con estos plásmidos, se indujo la expresión de proteínascon IPTG. Se evaluó la capacidad de unión de las proteínas quimerasrecombinantes a bacterias vivas y tratadas con ácido/calor por microscopia defluorescencia y citometría de flujo. Se construyó un nuevo vector de destino(Gateway) mediante un cassette personalizado 5?-HindIII-ATG-[RGS-His-tag-LysM5]-EcoRV-[ccdB/CmR(rfB)]-EcoRV-XbaI-3?en el vector vector pET-22b(+). Resultados y DiscusiónLysM5 se une a lapared celular de bacterias tratadas con ácido/calor más uniformemente que LysM,como se observó por microscopia de fluorescencia con Venus como proteínareportera. Se seleccionó LysM5 para construir un plásmido de expresiónbacteriana que permita etiquetar cualquier proteína de interés. Así logramospresentar una proteína obtenida en condiciones nativas y/o desnaturalizantessobre la superficie de bacterias como demostramos con Venus. ConclusionesEltratamiento de bacterias con ácido/calor aumenta la exposición de peptidoglicanoy permite la unión de Venus fusionada a LysM5 a toda la pared celular.Presentamos una plataforma de múltiples aplicaciones biotecnológicas como: lapresentación heteróloga de antígenos sobre bacterias como vectores de vacunas, lapurificación de proteínas etiquetadas e inmovilización de enzimas con fines industriales.