La amidotransferasa LipL de Staphylococcus aureus como nuevo blanco quimioterapéutico

SANCHEZ G.; SCATTOLINI, A.; MANSILLA M.C.

Rosario

Jornada; II Jornadas de Ciencia y Tecnología de la FBIOyF; 2023

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmaceuticas

Introducción: Las infecciones causadas por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) son un problema creciente para la salud global, demandando de forma urgente el desarrollo de nuevas drogas contra nuevos blancos bacterianos. El ácido lipoico (AL) es un cofactor azufrado conservado universalmente, que participa en el metabolismo oxidativo, además de ser un potente antioxidante (1). En bacterias Gram positivas, la amidotransferasa LipL juega un rol esencial debido a que está involucrada tanto en la síntesis como en la utilización del lipoato (2). LipL toma el grupo lipoilo unido a la proteína GcvH y lo transfiere a las subunidades E2 de los complejos deshidrogenasa.Esta enzima está altamente conservada en bacterias patógenas de este grupo, pero en mamíferos no hay proteínas con estructura primaria similares a la misma, lo que la convierte en un excelente blanco para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos. En este proyecto nos planteamos realizar una búsqueda de compuestos bioactivos que interfieran con la actividad amidotransferasa, utilizando bibliotecas de compuestos puros y extractos naturales.Resultados: Se realizó la puesta a punto de un ensayo de actividad amidotransferasa, sustituyendo lipoil-GcvH por el compuesto sintético AMF342 como sustrato de la enzima. Para ello se purificaron SaLipL y SaE2-PDH, la subunidad lipoilable del complejo piruvato deshidrogenasa. Se preparó una master mix conteniendo, Buffer Tris NaCl-HCl, 5 mM DTT, 1 mM MgCl2, la cual luego se fraccionó en tubos conteniendo 27 µM de E2-PDH, 40 µM de AMF342 y 4 µM LipL. A la reacción se le adicionó H2O hasta un volumen final de 20 µl y se incubó durante 2 hs a 37°C. La lipoilación llevada a cabo in vitro fue evidenciada por medio de ensayos de Western Blot, utilizando anticuerpos anti AL con posterior revelado con anticuerpos secundarios conjugados a HRP (Peroxidasa de Rábano). Una vez estandarizada la técnica, se repitieron las reacciones agregando posibles inhibidores, como el compuesto LPL004 (3), 8-Br Octanoato, Selenolipoato y extractos vegetales derivados de Polygonum acuminatum, los cuales no afectaron la reacción de amidotransferencia. Además, se probaron los compuestos Azida C6 y Alcohol C8. Los mismos mostraron una potencial inhibición sobre la lipoilación de E2-PDH. Conclusiones: Se desarrolló una metodología para medir in vitro la actividad amidotransferasa de S. aureus, que puede ser utilizada para el rastreo de inhibidores. El estudio e identificación de diferentes inhibidores resulta de interés para el desarrollo de nuevos compuestos quimioterapéuticos dirigidos al tratamiento de enfermedades producidas por MRSA.Referencias: 1) Cronan, J.E. Microbiol Mol Biol Rev. 2016, 80, 429-50. 2) Rasetto, N. y col., Molec. Microbiol., 2019, 112, 302-316. 3) Scattolini, A. y col. BIOCELL, 2023, Suppl. 1, MI-51