CARACTERIZACIÓN DEL PATÓGENO CORYNESPORA CASSIICOLA CAUSANTE DE LA MANCHA ANILLADA DE LA SOJA, EN EL NOA

MARÍA LAURA TOULET; MARÍA PAULA INSAURRALDE ROCCO; MARÍA FERNANDA TREJO; MARCELA ESCOBAR

Rosario

Congreso; Mercosoja 2019; 2019

Asociación de la Cadena de la Soja Argentina ACSOJA

INTRODUCCIÓNLa soja (Glycine max (L.) Merril) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Es la principal fuente de proteína vegetal para la alimentación animal en sistemas de cría intensiva y de aceites para alimentación humana. Adicionalmente, en estos últimos años es también uno los cultivos claves para la obtención de biocombustibles.Las enfermedades fúngicas constituyen uno de los principales factores que afectan negativamente al cultivo (Hartman et al., 1999). En la Argentina, se identificaron 40 patologías de soja, cuyos niveles de infección han incrementado desde 1990, debido al monocultivo, al uso de variedades susceptibles y a la labranza cero, entre otros factores (Ploper, 2011).En el Noroeste Argentino (NOA), la Mancha Anillada causada por el hongo necrotrófico Corynespora cassiicola, es considerada una de las principales patologías del llamado complejo de enfermedades de fin de ciclo (De Lisi et al., 2014). C. cassiicola es un fitopatógeno cosmopolita descripto en más de 70 especies de plantas hospederos. La Mancha anillada, se caracteriza por el desarrollo de lesiones necróticas circulares a irregulares en las hojas, primero de color pardo y luego marrón rojizas, de tamaño variable, rodeadas de un halo concéntrico amarillo debido a la acumulación de una toxina llamada casicolina (Barthe et al., 2007). El patógeno puede sobrevivir en restos de cosecha, en semillas infectadas y en el barbecho del suelo durante más de dos años. La diseminación de la enfermedad ocurre por la propagación de conidios en condiciones cálidas y húmedas, y las infecciones se ven favorecidas cuando la temperatura del suelo es moderada, entre 15-18ºC y la humedad relativa es superior al 80% (Hartman et al., 1999). Las prácticas agrícolas para controlar esta enfermedad incluyen el uso de cultivares con mayor resistencia y la aplicación de fungicidas químicos. Sin embargo, la mayoría de los cultivares comerciales disponibles actualmente son susceptibles a la enfermedad, y además se ha registrado una deficiencia en el control químico asociada a un aumento de resistencia del patógeno a los fungicidas (www.cnpso.embrapa.br/download/Doc324_VE.pdf en Reunião de Pesquisa de Soja da Região Central do Brasil: Embrapa Soja, Londrina PR, 2010). Ante el acelerado avance de esta enfermedad, y debido a la falta de materiales vegetales con buen comportamiento y prácticas eficientes de manejo fitosanitario, resulta imprescindible la caracterización de la diversidad del patógeno y el estudio de la interacción C. cassiicola/soja, en miras al desarrollo de nuevas estrategias de control de la enfermedad. MATERIALES Y MÉTODOS: Prospección de la enfermedad de la mancha anillada en el NOA y aislamiento del patógeno. Se obtuvieron aislados del patógeno a partir de muestras sintomáticas de soja durante la campaña 2014-2015 en tres ambientes agroecológicos diferentes de la región sojera del NOA: (norte de Salta de la Finca Amparo (AM) y Estancia Los Mirkos (ELM), noreste de Tucumán de Subestación Monte Rendondo (MR) y sur de Tucumán de la localidad La Cocha (LCH). Obtención de cultivos monospóricos: Se optimizó una metodología para la obtención e identificación de colonias puras a partir de un único conidio fúngico utilizando el protocolo modificado de la sección Fitopatología de la EEAOC (Fernández Valiela, 1975). Se eligieron un total de 24 aislados de C. cassiicola procedentes de diferentes ambientes agroecológicos, localidades y variedades. Todas las muestras fueron conservadas mediante dos metodologías diferentes: 1) micelio crecido en tiras de papel de filtro sobre medio APG 1,5% a -20ºC (Smith et al., 1994), 2) discos de micelio en agua a 4ºC (Método de Castellani) para cultivos de origen o bien, en glicerol 20 % a -70°C para aislados monospóricos obtenidos de ellos.Caracterización cultural de las colonias (fenotipo cultural). Se sembró un disco de micelio de 0,4 mm de diámetro de cada aislado puro en el centro de una caja de Petri con APG 2%, se incubó en condiciones óptimas de crecimiento del microorganismo (luz blanca con fotoperiodo de 12 h luz, humedad relativa 70% y 26±2°C). Se realizaron observaciones de velocidad de crecimiento, forma de crecimiento, color del anverso y reverso y aspecto general de la colonia de cada cultivo monospórico. Caracterización morfológica microscópica de los cultivos monospóricos. Se determinó bajo microscopio óptico (40x,) la forma y dimensiones en longitud y grosor de los conidios presentes, de cada aislamiento a partir de una suspensión de conidios en agua destilada estéril. Así mismo, se determinó la abundancia relativa de conidios en un peso determinado de micelio.Identificación genética de la especieSe identificaron molecularmente los aislados de C. cassiicola mediante amplificación de la región ITS, utilizando los cebadores ITS1 e ITS4. Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa al 2%. Se emplearon como controles negativos aislados monospóricos de hongos patógenos de frutilla. Ensayos fitopatológicos. Se evaluó el comportamiento fitopatológico de los aislados de C. cassiicola frente a plantas de la variedad A8000 RG (VIII) de soja en estadío vegetativo temprano de crecimiento (V4). La inoculación se realizó con una suspensión de conidios de los aislados y se evaluó la evolución de la sintomatología a diferentes tiempos posteriores a la infección. Se determinaron la incidencia y severidad de los síntomas siguiendo una escala que se extiende de 1 a 5 en grado creciente de severidad (Soares et al., 2009). RESULTADOS: A partir de 204 cultivos de origen aislados de tejido vegetal sintomático procedente de los diferentes ambientes agroecológicos muestreados (120 del norte de Salta, 50 del noreste Tucumán y 34 del sur de Tucumán), se eligieron aquellos procedentes de las variedades Munasqa, DM6563, DM 6.8, por estar presentes en 2 o 3 regiones, y se obtuvieron un total de 243 cultivos monospóricos (colonias obtenidas a partir de un único conidio). Los aislados puros fueron conservados por diferentes metodologías generando un banco de germoplasma de C. cassiicola de nuestra región. Finalmente se eligieron un total de 24 aislados monospóricos que fueron identificados mediante análisis molecular y caracterizados mediante análisis morfológicos, culturales, y patogénicos. En base al aspecto y forma de la colonia, el color del anverso y reverso de la misma, y al estudio de velocidad de crecimiento, se identificaron 5 fenotipos culturales distintos, 4 de ellos típicos de la especie C. cassiicola y un restante no descripto en bibliografía. Mediante microscopía óptica se observó que los conidios, se caracterizan por ser lisos, hialinos, de forma y tamaño variable, solitarios o en cadena. Con respecto al contorno de los conidios, se observó una predominancia de conidios rectos sobre curvos en todos los fenotipos, independiente de la variedad y las regiones de procedencia. La frecuencia de distribución de pseudoseptos fue muy variable entre los aislados independientemente del fenotipo. La abundancia relativa de conidios presentó una gran variación entre aislados, que se extiende desde 5 hasta 100 conidios/mg de micelio, con un valor predominante de 15 conidios/mg aproximadamente. En base a estos resultados pudimos determinar que los caracteres morfológicos de los genotipos analizados coinciden con los descriptores taxonómicos para la especie en estudio. La identificación molecular se realizó con los cebadores ITS1/ITS4. Se amplificó una banda de aproximadamente 600 pb para todos los aislados en estudio. En el caso del control de ADNr de Colletotrichum acutatum se obtuvo un producto de amplificación de aproximadamente 630 pb. Posteriormente, se llevó a cabo la digestión enzimática de los fragmentos amplificados con dos enzimas de restricción diferentes (EcoRI y TaqI). Para todos los aislados analizados se obtuvo un mismo perfil de bandas, mientras el ADNr correspondiente a C. acutatum presentó un perfil de bandas distinto. Los perfiles obtenidos, coinciden con los resultados predichos in silico para C. cassiicola, por lo que fue posible confirmar la identidad de los aislados, sin embargo, esta metodología no resultó útil para reflejar variabilidad entre los mismos. Con el objetivo de confirmar la identidad de los aislados y a su vez detectar diferencias puntuales en la secuencia amplificada de aislados de C. cassiicola pertenecientes a los cinco fenotipos identificados en este estudio, se secuenciaron los fragmentos amplificados a partir de las regiones ITS1-ADNr 5,8S-ITS2 de un aislado representativo de cada uno de ellos. La secuencia consenso obtenida para cada fragmento, fue comparada con las secuencias depositadas en el banco de datos de acceso libre GenBank. Si bien se seleccionaron aislados de diferentes fenotipos que sean lo más diversos posible en cuanto a su procedencia, todas las secuencias presentaron 100% de identidad en la totalidad de su extensión, entre ellas y con una cepa de C. cassiicola aislada de árboles de palta en el estado de Florida, EEUU (número de accesión KU593529). Finalmente, se realizaron ensayos de patogenicidad con los 24 aislados de C. cassiicola bajo condiciones controladas, en plantas de soja de la variedad A8000 RG (VIII). Todos los aislados analizados causaron síntomas típicos de la enfermedad de la mancha anillada, aunque con distintos grados de severidad. La aplicación de la suspensión de conidios produjo lesiones necróticas visibles a simple vista a partir de los 4 días post-inoculación. No se observaron síntomas en las plantas usadas como control, que fueron tratadas con agua destilada estéril y luego sometidas a las mismas condiciones de temperatura y humedad que las plantas inoculadas con cada uno de los aislados. Durante el desarrollo de la enfermedad, las lesiones iniciales se caracterizaron por ser necrosis puntuales y de color pardo y con el paso de los días, aumentaron el tamaño por adición de anillos concéntricos, tornándose desde circulares a irregulares con un color pardo-rojizo y en la mayoría de los casos rodeadas de un halo amarillo.Si bien el grado de virulencia de los aislados analizados es variable, los resultados sugieren que podría estar asociado a la región geográfica de procedencia de los mismos. Los aislados provenientes de finca ELM de Salta causaron un mayor desarrollo de la enfermedad, luego siguen aquellos aislados colectados en el noreste de Tucumán (MR) que ocasionan una sintomatología moderada, y finalmente los procedentes del Sur de Tucumán (LC) que producen una leve sintomatología. Sorprendentemente, los aislados derivados de la finca AM de Salta, cercana a ELM, presentaron una virulencia altamente variable frente a A8000, que permitió identificar interacciones contrastantes, tanto aquellas de tipo incompatible que no presentan ninguna lesión de mancha anillada como las de tipo compatible, que se caracterizan por un avance significativo de la enfermedad. En cuanto a la asociación virulencia-fenotipo cultural, los aislados de fenotipo D fueron los de mayor virulencia y aquellos de fenotipo C fueron los menos agresivos, ya que establecieron interacciones del tipo compatible e incompatible con el cv. A8000, respectivamente, en el 80% de los casos. Por lo tanto, podemos sugerir que la patogenicidad en la interacción C. cassiicola-cv. A8000 de soja está asociada al ambiente agroecológico de procedencia del aislado, mientras que no es absolutamente dependiente del fenotipo cultural del mismo. CONCLUSIONES: Se obtuvieron 204 cultivos de origen aislados del hongo patógeno C. cassiicola procedentes de tres ambientes agroecológicos del NOA durante la campaña 2014/2015y se generó una colección de 243 genotipos monospóricos de C. cassiicola.Los aislamientos de C. cassiicola presentaron diferencias en sus características culturales, lo que permitió identificar 5 fenotipos, diferenciados en color, aspecto y tamaño de la colonia.Se confirmó que los genotipos fúngicos bajo estudio pertenecen a la especie C. cassiicola mediante la amplificación de la región de ADNr comprendida entre las secuencias espaciadoras transcriptas ITS1-ITS2.Se logró reproducir la enfermedad de la mancha anillada bajo condiciones controladas en plantas de soja de la variedad A8000 RG y se ajustó una escala de severidad para evaluar la sintomatología. Los ensayos fitopatológicos indicaron que los genotipos de C. cassiicola difieren en el grado de severidad e incidencia de la enfermedad frente a la variedad A8000 RG de soja, lo que permitió identificar con claridad interacciones mediadas por aislados no virulentos (incompatibles), medianamente virulentos y de alta virulencia (compatibles), no asociadas a los fenotipos descriptos pero si al ambiente de procedencia. Por esto, actualmente nuestro grupo de trabajo está abocado a caracterizar genotípicamente las poblaciones de C. cassiicola procedentes de distintos ambientes, para analizar si la virulencia podría estar asociada al genotipo del patógeno.