Proteómica diferencial de macrófagos humanos tratados con apolipoproteína A-I: Posible rol de Nrf2 en la respuesta antioxidante

IVO DIAZ L.; TREJO, SA; GARDA H.; GONZALEZ M.

La Plata

Jornada; Jornadas de Investigación 2018; 2018

Secretaría de Ciencia y Técnica de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de La Plata

Introducción: Laaterosclerosis (acumulación lipídica en paredes arteriales) junto con otrasenfermedades cardiovasculares, es una de las principales causas de muerte enpaíses industrializados. La apolipoproteína humana A-I (apoA-I) es el componenteproteico mayoritario de las lipoproteínas de alta densidad (HDL). La HDL es la principallipoproteína encargada del transporte reverso del colesterol (TRC), proceso porel cual el exceso de colesterol es transportado desde los tejidos periféricoshacia el hígado para ser excretado como sales biliares y está involucrado en lafisiología natural de la prevención del desarrollo aterosclerótico. Estudiossobre los sistemas de transducción de señales activados o inhibidos por lainteracción celular con apoA-I intentan dilucidar los mecanismos molecularesque aún son desconocidos y que estén involucrados en las primeras etapas TRC.Conocer los procesos celulares involucrados en el TRC facilita una perspectivacon implicancia clínica para la prevención y tratamiento del desarrollo deaterosclerosis.Objetivos: Determinar losniveles de expresión de distintas proteínas involucradas en la respuestacelular de macrófagos humanos estimulados con apoA-I a concentracionesfisiológicas. Materiales y métodos: La ApoA-Irecombinante se obtuvo mediante expresión en E. coli y posterior purificación por cromatografía de afinidad.Para los ensayos celulares se utilizaron monocitos humanos THP-1, los cuáles fueronmantenidos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% suero fetal bovino hastaconfluencia. Los monocitos fueron diferenciados a macrófagos por estimulo conésteres de forbol (PMA-1ng/ml). Triplicados biológicos fueron incubados conRPMI sin suero (tratamiento control) y RPMI sin suero suplementado con 30µg/mlapoA-I durante 12h. La extracción de proteínas totales se realizó con bufferRIPA separando las proteínas solubilizadas de otros restos celulares porcentrifugación a 12.000 r.p.m. a 4°C. Los extractos proteicos totales fuerontratados con DTT (10mM) e Iodoacetamida (20mM) y luego las proteínas fueronprecipitadas por agregado de TCA (20% m/v). El pellet proteico fue lavado conacetona para remover restos lipídicos y llevado a sequedad bajo aire estéril.Las muestras fueron tripsinizadas, separadas por columna de fase reversa (C18)y analizadas en el espectrómetro cuadrupolo con tecnología orbitrap: Q-Exative?.Los espectros obtenidos fueron analizados con dos softwares distintos pararobustecer la fidelidad de los resultados: Proteome Discoverer y MaxQuant. Lascantidades relativas de las proteínas identificadas fueron analizadasestadísticamente por t-Student mediante el software Perseus. La validación delos resultados obtenidos fue realizada por western blot con anticuerpospoliclonales generados en ratón (Santa Cruz Biotechnology). La adquisición deimágenes se realizó por ImageQuant y las cuantificaciones relativas de lasbandas fueron realizadas mediante el software ImageJ.Resultados: Los espectrosMS/MS permitieron identificar alrededor de 2000 proteínas en cada triplicadobiológico. Se detectaron un total de 7 proteínas con niveles diferenciales deexpresión en las células tratadas con apoA-I. El análisis por western blot de lasproteínas: proteína 1 con dominio EH (EHD1); molécula de adhesión intracelular1 (ICAM-1); hemo oxigenasa 1 (HO-1); metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9);homólogo de la proteína regulatoria de biogénesis ribosomal (RRS1) y Sequestosoma-1(p62), validó los niveles de expresión diferenciales de las mismas obtenidospor espectrometría de masas.Conclusiones: El tratamientode macrófagos THP-1 con apoA-I incrementa los niveles celulares de lasproteínas ICAM-1, HO-1, p62, MMP9, EHD y RRS1. La sobreexpresión de HO-1 yp62, cuyos genes son regulados por el factor nuclear eritroide 2 (Nrf2) enrespuesta al desequilibrio redox en la célula, nos permite plantear comohipótesis que apoA-I podría activar la vía mediada por dicho factor. Al momentose están realizando estudios adicionales para profundizar sobre el mecanismo deactivación de Nrf2 mediado por apoA-I.