Efecto de la coadministración de TMPyP4+ y EudragitE100 en la fotoinactivación de P. aeruginosa, evaluado por citometría de flujo y microscopía confocal de barrido láser

CAMPAGNO, LUCIANA P.; ALOVERO, FABIANA L

La Plata, Buenos Aires

Congreso; V Reunión Grupo Argentino Fotobiología. GRAFOB; 2020

P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa, poco usada como modelo de estudio en el ámbito de la Terapia Fotodinámica Antimicrobiana. Desarrollar esta alternativa terapéutica, resulta de interés debido a la creciente resistencia de P. aeruginosa a los antimicrobianos disponibles. Nuestros estudios previos demostraron que el fotosensibilizador (FS) catiónico TMPyP4+ (5,10,15,20-tetrakis(N-metil-4-piridil)porfirina) es eficaz en la fotoinactivación de P. aeruginosa y que la coadministración con el polímero catiónico Eudragit E100 (EuE) potencia el efecto. Surgen como interrogantes e hipótesis: ¿Por qué la combinación EuE/TMPyP4+ erradica P.aeruginosa con menor concentración de TMPyP4+ y dosis de luz?, ¿Será que el polímero catiónico contribuye a modificar la interacción de TMPyP4+ con la célula bacteriana? Se estudiaron los efectos de TMPyP4+ (1µM), EuE (800 µg/mL) y su combinación EuE/TMPyP4+ (1µM/800 µg/mL) en P.aeruginosa FQ-R1 expuesta a cada tratamiento 30 min en oscuridad + 30 min de irradiación con luz visible (51,7 J/cm2), utilizando citometría de flujo (TMPyP4+: λexc: 407 nm y λem: 710 nm) y DiBAC, probe fluorescente que evidencia cambios en el potencial de membrana. Además, por microscopía confocal de barrido láser (CLSM) se complementó el análisis. Por citometría de flujo se observó la aparición de una población fluorescente expuesta al FS y esto fue incrementado notablemente en cultivos tratados con EuE/TMPyP4+. La proporción de población fluorescente se redujo por sucesivos lavados de cultivos los tratados con TMPyP4+, mientras permanece inalterada en los tratados con EuE/TMPyP4+, indicando mayor interacción del Fs con la célula bacteriana. Tanto TMPyP4+ como EuE producen parcial despolarización de la membrana citoplasmática. Esto se ve incrementado cuando ambos compuestos catiónicos son coadministrados. Los cultivos expuestos a EuE y EuE/TMPyP4+ exhiben dispersión en el tamaño celular (FSC) respecto del control y aumentada granularidad (SSC). Por su parte, cultivos expuestos al FS solo exhibieron un leve cambio en la complejidad interna de la célula. Por CLSM se observó el Fs intracelular en el tiempo evaluado. No obstante, cultivos tratados con TMPyP4+exhiben zonas fluorescentes distribuidas de manera heterogénea en la célula bacteriana. En contraste, la coadministración de EuE/TMPyP4+ permite observar fluorescencia homogénea en toda la bacteria y la intensidad de fluorescencia es mayor, confirmando que el polímero catiónico contribuye a una mayor interacción/internalización de TMPyP4+ en la célula bacteriana. En conclusión, ambos compuestos catiónicos interactúan con la célula bacteriana y provocan despolarización parcial en la membrana citoplasmática. No obstante, la coadministración EuE/TMPyP4+ incrementó estos efectos, generando mayor internalización del FS, evidenciando también alteraciones de tamaño celular y granularidad citoplasmática, conduciendo en conjunto a una más eficiente fotoinactivación de P.aeruginosa