Microscopia de Iluminación Selectiva de Planos: un análisis del modelo de la formación de la imagen

ETCHART JUAN IGNACIO; DIAZ ZAMBONI JAVIER E. ; ADUR JAVIER F.; CASCO VÍCTOR H.

La Falda - Córdoba

Congreso; 5° Congreso Argentino de Microscopía SAMIC; 2018

Sociedad Argentina de Microscopia (SAMIC)

En microscopia de fluorescencia, la calidad y resolución de las imágenes puede lograrse, entre otras estrategias, mediante la reducción de la fluorescencia fuera de foco. Para lograr esto, las estrategias pueden incluir la obturación física de su paso (por ej. mediante un pinhole), excitando sólo una porción acotada del espécimen, o mediante una combinación de ambas. La microscopia de iluminación selectiva de planos (SPIM, selective plane illumination microscopy) es una técnica en la que se emplean dos caminos ópticos diferentes que separan los haces de luz de excitación y de emisión. El principio se basa en incidir sobre la muestra, perpendicularmente al eje óptico de la lente objetiva, con una lámina de luz láser que coincide con su plano focal. La lámina de excitación se forma empleando una lente cilíndrica. Ésta estimula la fluorescencia de una delgada porción de la muestra la que es registrada con una cámara digital, luego de atravesar la lente objetiva[1](ver Figura 1(a)). Como ocurre en otras técnicas de microscopia, desplazando la muestra en dirección del eje óptico de la lente objetiva, se logra su seccionamiento óptico. Dado que el sistema SPIM a desarrollar se montará sobre un microscopio de fluorescencia de campo amplio (MFCA), resultó de interés analizar cómo inciden en la formación de la imagen, factores críticos como el perfil de excitación de la lámina y la función de esparcimiento puntual (PSF, point spread function) de la lente objetiva. En microscopia de fluorescencia, la imagen de una fuente puntual es el producto del perfil de excitación y la PSF de la lente de detección[2]. En el caso de MFCA el perfil de excitación tiene un amplio rango de cobertura, abarcando un gran volumen de la muestra. En SPIM, la cobertura del perfil de excitación forma una lámina, que acota la excitación de la fluorescencia a un delgado espesor de la muestra. De esta manera, se logra tener un mejor contraste en las imágenes, atenuando la incidencia de las aberraciones esféricas en las secciones ópticas que comúnmente se observan en MFCA.En el presente trabajo se generó un perfil gaussiano para modelar la excitación de la lámina, con la siguiente configuración: láser de longitud de onda de 520 nm, diámetro de haz 1,6 mm y lente cilíndrica con distancia focal de 30 mm). Para la modelar la PSF de la lente objetiva se utilizó un patrón de Airy tridimensional. Se asumió una magnificación de 10X, apertura numérica 0,40, longitud de onda 560 nm y desplazamiento en el eje óptico de 1 μm. En la Figura 1(b) se puede observar la PSF resultante del SPIM y la correspondiente a MFCA con sus respectivos perfiles de excitación. Para analizar el impacto que tiene la excitación de plano selectivo en el muestreo por seccionamiento óptico, se simuló el registro de la proteína GAL4 en cerebro de Drosophila, a partir de un registro real de microscopia confocal[3]. Los resultados, presentados en la Figura 1 (c), demuestran que con la eliminación de la fluorescencia fuera de focoen las secciones ópticas de la SPIM, el contraste de las imágenes mejora respecto de MFCA. Por su parte, en las secciones axiales, se observa una mejora en la resolución, debido a que la gran dispersión axial que presenta la PSF del MFCA se ve reducida por el perfil gaussiano del plano de excitación.