EVALUACIÓN DE UN MARCADOR MOLECULAR PARA LA CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE BABESIA BOVIS

BARAVALLE, E.; THOMPSON, C; VALENTINI, B; PALACIOS, C; FLORÍN CHRISTENSEN, M; TORIONI DE ECHAIDE, S; ECHAIDE, I.

Mar del Plata, Argentina

Otro; XVI Reunión científico técnica de la AAVLD; 2006

Asociación argentina de veterinarios de laboratorios de diagnóstico

Babesia bovis es una de las especies causantes de la babesiosis bovina, enfermedad enzoótica en áreas tropicales y subtropicales del mundo donde existe su vector natural, la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Para su prevención, en la Argentina se utiliza una vacuna basada en la cepa BboR1A, atenuada en su patogenicidad a través de pasajes seriados en terneros sin bazo. Los aislamientos de B. bovis incluyen subpoblaciones con distintos grados de patogenicidad y durante el proceso de atenuación in vivo, se favorecería el enriquecimiento de alguna población menos patógena. El gen bv80 de B. bovis, contiene secuencias repetitivas en tandem que varían en longitud  separadas por regiones conservadas de ADN, característica que permitió establecer algunas diferencias entre cepas de B. bovis australianas. El objetivo de este trabajo preliminar fue analizar el gen bv80 para evaluar la cepa BboR1A utilizada como vacuna en Argentina respecto de otras cepas de referencia, caracterizar el proceso de atenuación y estudiar aislamientos naturales de B. bovis de diferentes regiones geográficas. Para establecer diferencias entre cepas con diferentes atributos y a partir de secuencias del gen bv80, se analizaron muestras de ADN obtenido de cepas de referencia multiplicadas en forma axénica in vitro e/o in vivo.Las cepas BboR1A y BboS2P se evaluaron in vivo a los nueve meses después de la inoculación. A partir del ADN de estas cepas multiplicadas in-vitro se amplificó el gen bv80 mediante PCR y se clonó en un vector pGEM-T. Cinco clones de cada una de ellas fueron luego seleccionados y secuenciados. Para diferenciar in vivo estas cepas, se analizaron muestras de sangre de dos bovinos vacunados con la cepa BboR1A y desafiados tres meses después con la cepa BboS2P.Los primers específicos para el gen bv80 amplificaron secuencias en todas las muestras evaluadas, cuyos fragmentos observados en geles de agarosa, variaron entre 600 y 900 pb. No hubo amplificación a partir del ADN de B. bigemina ni del H2O. Las cepas de referencia BboR1A y BboS2P multiplicadas in vitro e in vivo después de los nueve meses de la inoculación, mantuvieron el mismo patrón de bandas. La secuencia de nucleótidos mostró que los cinco clones de BboR1A tenían un tamaño de 871 pb, mientras que los cinco clones de BboS2P, un tamaño de 676 pb. Se observó además la presencia de una región de secuencias repetitivas organizadas en tandem, a partir del nucleótido 227, las cuales fueron diferentes entre las dos cepas evaluadas. En los dos bovinos vacunados con BboR1A y desafiados con la cepa patógena BboS2P sólo se pudo amplificar un fragmento similar al de esta última cepa. Respecto de las muestras de sangre de los animales infectados naturalmente con B. bovis, se encontraron diferentes patrones de bandas simples o múltiples, algunos semejantes a los de la cepa patógena BboS2P pero ninguno de ellos fue coincidente con la cepa atenuada BboR1A. Las cepas atenuadas BboR2A, BboM1A y BboBrasil mostraron un patrón de bandas simples, diferentes entre si y respecto de la cepa BboR1A utilizada como vacuna en Argentina. La cepa patógena BboS4P multiplicada in vitro mostró una doble banda de 800 y 900 pb aproximadamente. Durante el proceso de atenuación de la cepa BboR2A se observó una doble banda de aproximadamente de 770 y 850 pb hasta el pasaje 18, a partir del cual sólo se amplificó el fragmento de 850 pb.La invariabilidad del tamaño del fragmento de bv80 amplificado después de nueve meses de la inoculación de bovinos con BboR1A y BboS2P sugiere que este gen es estable para cada cepa. Sin embargo se debe determinar si esa estabilidad persiste en la cepa BboS2P después de pasajes a través de R. microplus. Dado que la BboR1A no se transmite por garrapatas, el gen bv80 permitiría identificar específicamente esta cepa vacunal de otras atenuadas, de las cepas patógenas de referencia y de los aislamientos naturales de B. bovis. La imposibilidad de detectar la secuencia específica de bv80 de la cepa BboR1A en los dos bovinos inoculados con ambas cepas vacunal y patógena, podría deberse a una baja concentración de la BboR1A respecto de la cepa patógena, la cual fue inoculada tres meses después de la vacunación. El bv80 per se o junto a otros marcadores moleculares, permitiría la caracterización del procedimiento de atenuación y la identificación de la cepa vacunal en estudios epidemiológicos.