GENOTIPIFICACIÓN DE CEPAS DE BABESIA BIGEMINA A TRAVÉS DE LA TEMPERATURA DE DISOCIACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN rap-1c DURANTE SU AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL.

THOMPSON, C; BARAVALLE, M.E; TORIONI DE ECHAIDE, S; MANGOLD, A; ECHAIDE, I.

Mercedes, Corrientes, Argentina

Otro; XVIII Reunión científica Técnica de la AAVLD; 2010

AAVLD

Babesia bigemina es una de las dos especies de protozoarios apicomplexa que causa la babesiosis bovina en Argentina. La enfermedad es endémica en el área infestada por el vector, la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Para la prevención de la babesiosis, se utilizan vacunas vivas basadas en cepas cuya patogenicidad se atenuó en forma estable. Las bases biológicas y moleculares de esa atenuación no han sido establecidas. El estudio de la diversidad genética a partir de genes seleccionados de cepas con fenotipos de patogenicidad diferente permitiría elucidar el proceso de atenuación. El gen rap-1c, que codifica una proteína asociada al complejo apical de B. bigemina, posee una secuencia variable en el extremo carboxi-terminal, considerada un marcador molecular útil para diferenciar cepas con diferentes fenotipos (Thompson et al, 2008). El análisis de HRM (High Resolution Melting) permite analizar cambios en la temperatura de disociación de las dobles hebras de ADN luego de una PCR en Tiempo Real en presencia de un fluorocromo (RTPCR). Así, es posible discriminar secuencias que difieren en la mutación de una base nucleotídica. Este análisis ha sido utilizado para caracterizar cepas de otros protozoarios apicomplexa como Plasmodium falciparum (Andriantsoanirina et al., 2010) y Babesia canis (Adaszek y Winiarczyk, 2010). El objetivo de este trabajo fue analizar los cambios de la temperatura de disociación de el extremo carboxi-terminal del gen rap-1c (RTPCR-HRM) de B. bigemina, para caracterizar cepas y aislamientos patógenos y diferenciarlas de cepas cuya patogenicidad se atenuó en forma estable como ocurre con algunas cepas vacunales. El gen rap-1c fue amplificado de todas las cepas de B. bigemina y del aislamiento mediante RT-PCR, mientras que no se detectó amplificación de B. bovis ni de la muestra para el control de reactivos. El análisis de distancia agrupó las cepas de B. bigemina atenuadas en un cluster y las patógenas junto al aislamiento BbiS4 en otro. El análisis por RTPCR-HRM del gen rap-1c permitió también identificar dos genotipos (g). El gA incluyó las cepas con fenotipo atenuado y el gP  aquellas con fenotipo patógeno (Tabla 1). Las cepas atenuadas en su patogenicidad mostraron una temperatura de disociación del ADN entre 86,81ºC y 86,99 ºC, y las patógenas entre 87,20 ºC y 87,29 ºC. Se encontraron dos mutaciones puntuales entre el gA y el gP de una Timina (T) por una Guanina (G) y de una Adenina (A) por una G. La cepa BbiS2A-c fue la única del gA que mostró variación de un nucleótido, mientras que en el gP las cepas BbiS2P-c y BbiS2P presentaron dos mutaciones puntuales. Las dos mutaciones detectadas en la secuencia de rap-1c entre las cepas atenuadas respecto de las patógenas (T por G y A por G) fueron determinantes para la discriminación entre el gA y el gP en correspondencia con el fenotipo. En contraste, la única mutación encontrada en rap-1c de la cepa BbiS2A-c resultó insuficiente para su discriminación dentro del gA. Del mismo modo las dos mutaciones registradas en la secuencia rap-1c de BbiS2P-c y BbiS2P, no permitieron su discriminación dentro del gP mediante el método de RTPCR-HRM. El aislamiento BbiS4 mostró un gP, en correspondencia con el fenotipo evidenciado en el bovino con babesiosis clínica de donde se obtuvo el aislamiento. El limitado nivel de confianza (56%) que mostró BbiS4 mediante el análisis de RTPCR-HRM, podría estar asociado a la coexistencia de diferentes genotipos incluidos en los aislamientos naturales (Andriantsoanirina et al, 2009). El análisis del gen rap-1c mediante el método de RTPCR-HRM resultó de utilidad para la discriminación genotípica entre cepas de B. bigemina con fenotipo diferente y cultivadas bajo diferentes condiciones (in vitro o in vivo). Estos resultados, sumados a los obtenidos con otros genes polimórficos, brindará información relativa a la diversidad genética de cepas de B. bigemina.